本文關(guān)鍵詞：IL-8促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞EMT的作用及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： IL-8 乳腺癌 EMT PI3K/AKT Snail C14orf166

【摘要】：目的探討IL-8(interleukin-8)促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7,SK-BR-3上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的作用及其相關(guān)機(jī)制,初步闡明IL-8在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。方法1.采用蛋白質(zhì)印記法(western blotting, WB)和半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)檢測人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231內(nèi)IL-8受體CXCRA, CXCRB的表達(dá)；采用細(xì)胞因子IL-8處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, SK-BR-3, MDA-MB-231,光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；Western blotting檢測IL-8處理后乳腺癌細(xì)胞內(nèi)EMT標(biāo)志蛋白上皮鈣粘蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)和纖維連接蛋白(Fibronectin)表達(dá)的變化。2.IL-8處理人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, SK-BR-3后,采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR),實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)和Western blotting檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail mRNA及蛋白水平的變化。3.采用IL-8下游主要信號(hào)通路MAPK/ERK1/2, PI3K/AKT, JAK/STAT3的抑制劑及IL-8處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, Western blotting檢測信號(hào)通路抑制劑對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT標(biāo)志蛋白表達(dá)的影響；采用PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制劑及IL-8處理乳腺癌細(xì)胞株MCF-7,SK-BR-3,劃痕實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞遷移能力的變化,Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的變化,同時(shí)采用半定量PCR(semi-quantitative RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, QRT-PCR)檢測Snail的mRNA表達(dá)變化,采用Western blotting檢測EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin, Vimentin, Fibronectin及Snail蛋白表達(dá)水平變化。4.采用免疫共沉淀技術(shù)以富集乳腺癌細(xì)胞株SK-BR-3中Snail及與Snail結(jié)合的蛋白。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離免疫沉淀復(fù)合物,經(jīng)銀染后將膠按大小大致平均切成三份,送北京華大蛋白公司進(jìn)行質(zhì)譜(LC-MSMS)檢測。分析質(zhì)譜結(jié)果以篩選與Snail相互作用的蛋白。NCBI數(shù)據(jù)庫查詢篩選出來的蛋白的功能特點(diǎn)并采用網(wǎng)頁軟件PEPSITE檢測其與Snai相互結(jié)合能力的大小。5.采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry, IHC)檢測良性乳腺增生、原位乳腺癌及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌臨床標(biāo)本中IL-8,CXCRB, E-cadherin, Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表達(dá)水平的相關(guān)性。6.建立裸鼠乳腺癌移植瘤模型,瘤內(nèi)注射IL-8,以驗(yàn)證IL-8對(duì)裸鼠乳腺癌生長、肝肺轉(zhuǎn)移的影響,并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry, IHC)檢測IL-8對(duì)乳腺癌移植瘤內(nèi)EMT標(biāo)志蛋白、Snail、C14orfl66以及TUBA1B表達(dá)的影響。結(jié)果1.Western blotting及半定量PCR結(jié)果均表明,1型IL-8受體CXCRA、2型IL-8受體CXCRB在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7均有表達(dá),而SK-BR-3及MDA-MB-231均只表達(dá)2型IL-8受體CXCRB;光學(xué)顯微鏡下觀察到IL-8可促進(jìn)MCF-7, SK-BR-3細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT,即細(xì)胞形態(tài)變得細(xì)長,出現(xiàn)偽足,細(xì)胞間粘附性下降而逐漸發(fā)生分離,而MDA-MB-231形態(tài)變化不大；Western blotting結(jié)果表明IL-8可下調(diào)MCF-7, SK-BR-3細(xì)胞上皮標(biāo)志分子E-cadherin的表達(dá),上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin及Fibronectin的表達(dá),即1L-8可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, SK-BR-3發(fā)生EMT,而對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞作用不明顯,后續(xù)試驗(yàn)選擇乳腺癌細(xì)胞株MCF-7, SK-BR-3作為研究對(duì)象。2.半定量PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blotting結(jié)果均表明,IL-8能顯著上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的mRNA及蛋白水平。3. Western blotting結(jié)果表明,IL-8通過PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生,即對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7間質(zhì)標(biāo)志分子Vimentin表達(dá)上調(diào)的作用,可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷；劃痕實(shí)驗(yàn)及Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,IL-8提高乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲的能力,可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷；IL-8上調(diào)Snail, Vimentin, Fibronectin并下調(diào)E-cadherin的作用也可被PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑阻斷。以上結(jié)果均表明IL-8可能是通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路,從而上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。4.免疫共沉淀蛋白復(fù)合物經(jīng)SDS-PAGE分離、質(zhì)譜定性檢測膠內(nèi)蛋白質(zhì),結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)C14orfl66和TUBA1B是與Snail相互作用的蛋白,且NCBI數(shù)據(jù)庫查詢到這兩個(gè)蛋白與癌癥侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。網(wǎng)頁軟件PEPSITE檢測到C14orfl66和TUBA1B與Snail相互結(jié)合能力較強(qiáng)。采用半定量PCR (semi-quantitative RT-PCR). Western blotting檢測,結(jié)果表明IL-8可上調(diào)C14orfl66和TUBAIB mRNA及蛋白的表達(dá),而PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑可阻斷此作用。5.免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry, IHC)檢測結(jié)果表明良性乳腺增生、原位乳腺癌及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌臨床組織標(biāo)本中IL-8, CXCRB, Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表達(dá)水平依次增高,相反地,上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)依次降低。6.裸鼠乳腺癌移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,注射細(xì)胞因子IL-8處理移植瘤后,與對(duì)照組相比,腫瘤體積及質(zhì)量明顯增大；小鼠肝、肺組織轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)增多,且經(jīng)HE染色后發(fā)現(xiàn),IL-8處理組肝肺轉(zhuǎn)移明顯；移植瘤經(jīng)免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測表明,IL-8處理組Vimentin, Snail, C14orfl66以及TUBA1B表達(dá)明顯增高,而E-cadherin表達(dá)明顯下降。結(jié)論1.IL-8促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SK-BR-3 EMT的發(fā)生且上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達(dá)。2.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)初步表明C14orfl66、TUBA1B與Snail相互作用,IL-8可通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞EMT的發(fā)生、上調(diào)Snail及C14orfl66及TUBAIB的表達(dá)。3.發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌臨床組織標(biāo)本中IL-8、CXCRB、Vimentin、 Snail、C14orfl66以及TUBA1B的表達(dá)水平明顯高于原位乳腺癌及良性乳腺增生疾病。IL-8促進(jìn)裸鼠乳腺癌移植瘤生長,及腫瘤肝肺轉(zhuǎn)移,并上調(diào)瘤內(nèi)Vimentin, Snail、C14orfl66及TUBA1B的表達(dá),下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：IL-8 乳腺癌 EMT PI3K/AKT Snail C14orf166
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對(duì)照5-7
• 中文摘要7-12
• ABSTRACT12-18
• 前言18-20
• 第一部分 IL-8對(duì)人乳腺癌細(xì)胞EMT及Snail表達(dá)的影響20-30
• 1 材料與方法20-26
• 2 結(jié)果26-28
• 3 討論28-30
• 第二部分 IL-8促人乳腺癌細(xì)胞EMT及上調(diào)Snail的機(jī)制探討30-41
• 1 材料與方法30-32
• 2 結(jié)果32-39
• 3 討論39-41
• 第三部分 IL-8對(duì)裸鼠乳腺癌移植瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響41-48
• 1 材料與方法41-43
• 2 結(jié)果43-47
• 3 討論47-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 文獻(xiàn)綜述52-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61

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