本文關鍵詞：結腸癌相關基因KPNA2的篩選驗證及其作用機制研究

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【摘要】：結腸癌是世界范圍內的常見惡性腫瘤之一,在我國,結腸癌的發(fā)病率不斷增加,已成為最常見的惡性腫瘤。目前,結腸癌的發(fā)病機制尚未闡明。細胞轉運相關蛋白的功能異常可引起癌基因及抑癌基因的轉運及定位功能異常,因此,細胞轉運相關蛋白可以作為腫瘤治療的潛在靶點。本課題聚焦于核轉運受體蛋白家族,通過Real-time PCR篩選該家族內與結腸癌相關的基因,經過Western blot驗證,并采用免疫組織化學技術分析包含203例樣品的結腸癌組織芯片,通過構建vsh RNA慢病毒載體抑制細胞中KPNA2的表達,體內和體外實驗評估KPNA2表達下調后對結腸癌細胞惡性表型的影響。結果發(fā)現:40例結腸癌樣品中,25例出現KPNA2的高表達,占總例數的62%;KPNA2在結腸癌組織中表達升高達5倍以上的例數有18例,占總數的45%,提示KPNA2作為結腸癌相關基因的可能性大;Western blot驗證結果顯示,大多數結腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對應的正常黏膜組織。組織芯片中KPNA2基因在結腸癌組織中的表達明顯高于正常腸上皮組織,并且KPNA2基因的高表達可以作為結腸癌患者預后判斷的獨立影響因素。體外功能實驗發(fā)現,KPNA2基因的下調可抑制結腸癌細胞的增殖、克隆形成和遷移能力;裸鼠成瘤實驗發(fā)現,KPNA2基因的下調可以抑制結腸癌細胞的體內致瘤能力。本實驗研究KPNA2基因在結腸癌中的表達模式及其在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用,為KPNA2基因在臨床診斷和治療的應用提供了理論基礎。第一部分五個候選癌基因在結腸癌組織中的表達目的:檢測5個Karyopherins家族成員KPNA2、KPNA4、KPNA5、KPNA7及KPNB1在結腸癌組織中的表達,以篩選該家族中與結腸癌相關的基因。方法:Real-time PCR檢測40對結腸癌組織及其配對的正常黏膜組織中5種基因的m RNA表達水平,并通過Wsetern blot分析驗證KPNA2在配對組織樣品中的蛋白表達情況。結果:1.40例樣品中,25例出現KPNA2的高表達,占總例數的62%;16例出現KPNA4的高表達,占總例數的40%;10例表現出KPNA5高表達,占總例數的25%;KPNA7和KPNB1高表達的例數分別為13例和9例,各占總例數的32%和22%。此外,KPNA2在結腸癌組織中表達升高達5倍以上的例數有18例,占總數的45%。2.Western blot驗證結果顯示大多數結腸癌組織中KPNA2的蛋白水平高于其對應的正常黏膜組織。結論:KPNA2基因是在結腸癌中發(fā)揮主要作用的Karyopherins家族成員,其在結腸癌組織中的m RNA水平及蛋白水平均高于正常組織。第二部分結腸癌組織芯片中KPNA2的表達及預后判斷價值的研究目的:免疫組織化學技術檢測KPNA2在結腸癌組織芯片中的表達,并分析其與結腸癌患者臨床病理特征的相關性。方法:免疫組織化學技術對203例結腸癌組織芯片進行染色,統(tǒng)計學方法分析KPNA2的表達與結腸癌患者臨床病理特征的相關性。結果:1.KPNA2在結腸癌組織中的表達高于其配對的正常黏膜組織,兩者具有統(tǒng)計學差異;KPNA2基因的高表達與結腸癌的AJCC分期、腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、遠處轉移、分化程度及Ki-67的表達顯著相關。2.KPNA2基因高表達患者的5年無病生存率和總體生存率明顯低于KPNA2低表達患者;KPNA2基因的高表達可以作為結腸癌患者預后判斷的獨立影響因素。結論:KPNA2基因是結腸癌預后的獨立診斷因素,可能與結腸癌的發(fā)生發(fā)展相關。第三部分KPNA2在結腸癌惡變進程中的生物學功能研究目的:構建KPNA2表達水平下調的結腸癌細胞模型,以進一步探討KPNA2基因對結腸癌細胞惡性生物學行為的影響。方法:運用vshRNA慢病毒載體抑制細胞中KPNA2基因的表達,構建RKO和HCT116兩種KPNA2表達下調的結腸癌細胞株;通過CCK-8、平板克隆、Transwell小室和裸鼠成瘤實驗,研究KPNA2表達下調后對結腸癌細胞惡性生物學行為的影響。結果:1.構建4個RNAi慢病毒載體候選靶點,并通過Real-time PCR和Western blot外源篩選出KPNA2-RNAi(23866-1)靶點對KPNA2基因敲減效率最顯著,為有效靶點。2.Real time PCR和Western blot驗證由vshRNA慢病毒載體構建的KPNA2表達下調的結腸癌細胞中,KPNA2基因的敲減效率達70%以上,提示KPNA2表達下調的結腸癌細胞株構建成功。3.體外功能實驗結果顯示:采用CCK-8檢測各組細胞活性,發(fā)現培養(yǎng)48、72小時后,KPNA2基因敲減細胞的活性較其對照組明顯下降;克隆形成實驗結果顯示KPNA2基因敲減細胞的克隆形成能力較對照組明顯下降。Transwell遷移實驗中,KPNA2基因敲減組穿過濾膜的細胞數明顯少于對照組。4.裸鼠成瘤實驗發(fā)現KPNA2基因的表達下調可以有效減弱結腸癌細胞的體內致瘤能力。結論:KPNA2基因表達下調后結腸癌細胞的增殖、克隆形成、遷移及裸鼠成瘤能力顯著降低。提示KPNA2基因表達下調可引起結腸癌細胞的惡性程度降低。
【關鍵詞】：結腸癌 KPNA2 診斷 預后
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
【目錄】：

• 摘要6-10
• Abstract10-14
• 中英文名詞對照14-16
• 緒論16-18
• 第一部分 五個候選癌基因在結腸癌組織中的表達18-34
• 1.引言18
• 2.材料和方法18-26
• 3.結果26-30
• 4.討論30-34
• 第二部分 結腸癌組織芯片中KPNA2的表達及預后判斷價值的研究34-48
• 1.引言34
• 2.材料和方法34-40
• 3.結果40-46
• 4.討論46-48
• 第三部分 KPNA2在結腸癌惡變進程中的生物學功能研究48-81
• 1.引言48
• 2.材料和方法48-66
• 3.結果66-79
• 4.討論79-81
• 全文總結81-82
• 參考文獻82-87
• 致謝87-89
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術論文情況與參研項目89

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本文編號：1048827