本文關鍵詞：β-arrestin2通過調(diào)控多藥耐藥基因1（MDR1）的表達影響乳腺癌多藥耐藥的相關性研究

  更多相關文章： β-arrestin2 乳腺癌 化療 多藥耐藥 MDR1/p-gp

【摘要】：[研究背景]乳腺癌嚴重威脅著女性的身體健康,化療是其非常有效的治療手段。然而,在乳腺癌臨床化療過程中,逐漸出現(xiàn)的多藥耐藥嚴重阻礙了化療的成功。多藥耐藥,即腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物出現(xiàn)抗藥性的同時,對其他結構、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也產(chǎn)生抗藥性。多藥耐藥的機制非常復雜,人類多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的p-糖蛋白(MDR1/p-gp)的過表達是其最主要的機制之一。P-gp是一種鑲嵌于細胞膜上的泵蛋白,該蛋白過度表達可以導致化療藥物從腫瘤細胞中外排增強,降低了細胞內(nèi)有效藥物濃度,從而使腫瘤細胞對于化療藥物表現(xiàn)出抵抗性�，F(xiàn)如今,盡管已開發(fā)了多種針對MDR1/P-gp的抑制劑及調(diào)節(jié)劑,但其毒性及副作用限制了其臨床應用,并未取得非常滿意的治療效果。近年來,基于調(diào)控P-糖蛋白轉(zhuǎn)錄的信號通路的分子靶向治療,或許可以為逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥帶來新的希望。β-抑制蛋白,包括β-arrestin2β-arrestin2,是一種廣泛分布在各種組織和細胞的多功能蛋白,其經(jīng)典的功能是介導G蛋白耦聯(lián)受體(GPCR)的脫敏和內(nèi)吞。此夕,β-arrestin2還可以結合其他信號分子,調(diào)節(jié)這些分子的磷酸化、泛素化或者細胞內(nèi)定位等,從而調(diào)控相應的信號通路。最近很多的研究表明β-arrestin2在很多病理過程中發(fā)揮重要作用,尤其是廣泛參與很多惡性腫瘤的演進過程。Mistre Alemayehu等研究發(fā)現(xiàn)β-arrestin2直接調(diào)節(jié)乳腺癌MDA-MB-231細胞中LPA誘導的侵襲和遷移過程。Buchanan等也發(fā)現(xiàn)β-arrestin2可以調(diào)節(jié)大鼠結腸癌的轉(zhuǎn)移過程。此外,在乳腺癌中,β-arrestin2也可以通過caspase-8通路發(fā)揮抗凋亡作用。我們最近的研究發(fā)現(xiàn),β-arrestin2還可能參與調(diào)節(jié)乳腺癌中MDR1/p-gp介導的多藥耐藥。我們發(fā)現(xiàn)在乳腺癌臨床標本中β-arrestin2與MDR1/p-gP的表達密切相關。同時,我們檢測了β-arrestin2在乳腺癌敏感細胞系ADM以及耐藥細胞系MCF-7和MDA-MB-231中的表達,發(fā)現(xiàn)其在耐藥細胞中的蛋白和mRNA水平均高于敏感細胞。因此我們推測β-arrestin2可能參與乳腺癌的多藥耐藥過程,從而干擾β-arrestin2可以逆轉(zhuǎn)乳腺癌化療過程中出現(xiàn)的多藥耐藥。[研究方法]1.分別用Q-PCR及Western blot的方法檢測3種乳腺癌細胞系ADM,MCF-7以及MDA-MB-231中β-arrestin2與MDR1/p-g的表達情況。2.乳腺癌敏感細胞MCF-7及MDA-MB-231分別給予濃度為0,1μmol/L, 2.5μmol/L,和5μmol/L的阿霉素作用72h后提取細胞總蛋白進行western blot檢測β-arrestin2及MDR1蛋白水平表達的改變。3.收集臨床乳腺癌標本進行β-arrestin2與MDR1/p-gp的免疫組化染色,并分析兩者之間的關聯(lián)性。4.設計并合成針對β-arrestin2基因的雙鏈干擾RNA序列以及非靶向性干擾序列作為陰性對照,將其定向插入到質(zhì)粒載體pSUPER.neo+GFP中,構建穩(wěn)定表達載體pSUPER-sip-arrestin2和pSUPER-siNC;pCDNA3.1-β-arrestin2-GFP全長表達載體由美國東田納西大學尹德領教授惠贈。5.上述質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染3種乳腺癌細胞,繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時后,分別用Q-PCR和Western blot檢測各組細胞中β-arrestin2與MDR1/p-gp在mRNA和蛋白水平的表達情況。應用MTS法檢測各組細胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶、順鉑的半數(shù)細胞致死量的改變。[實驗結果]1.對3種乳腺癌細胞系檢測發(fā)現(xiàn)β-arrestin2在耐藥細胞ADM中無論mRNA水平還是蛋白水平均較2種敏感細胞明顯升高,而4DR1/P-gp僅在ADM細胞中高表達,敏感株中幾乎不表達。2.MCF-7及MDA-MB-231細胞經(jīng)阿霉素誘導后通過、檢測發(fā)現(xiàn),vestem blot的蛋白水平呈濃度依賴性升高。β-arrestin2及MDR13.對臨床收集的106例乳腺癌樣本,用免疫組織化學染色檢測和β-arrestin2的表達,經(jīng)過分析二者MDR1/P-gp相關系數(shù)為0.227,呈低度相關性且有Pearson顯著意義P=0.016。4.轉(zhuǎn)染48h后,應用Q-PCR檢測各組細胞中β-arrestin2和MDR1 mRNA水平的表達情況,結果顯示：與對照組相比,β-arrestin2干擾組的β-arrestin2及MDR1 mRNA水平均明顯降低。Western blot檢測結果表明β-arrestin2干擾組細胞2種蛋白的表達水平也明顯降低。5.MTS法檢測各組乳腺癌細胞對4種化療藥物的耐受性,發(fā)現(xiàn)β-arrestin2干擾組細胞對阿霉素、紫杉醇、5-氟尿嘧啶和順鉑的半數(shù)細胞致死量(IC50值)明顯降低,耐藥性被不同程度逆轉(zhuǎn)。[結論]β-arrestin2與MDR1在乳腺癌細胞及組織中的表達具有一定的相關性,提示β-arrestin2可能通過調(diào)控MDR1的表達間接影響乳腺癌的多藥耐藥。干擾或過表達β-arrestin2可以抑制或促進MDR1的表達,從而影響細胞對化療藥物的耐受性。提示β-arrestin2有可能成為逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的靶點。
【關鍵詞】：β-arrestin2 乳腺癌 化療 多藥耐藥 MDR1/p-gp
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符號說明12-13
• 第一部分 β-arrestin2和MDR1基因在人體乳腺癌細胞系及人體乳腺癌組織中的表達情況13-40
• 前言13-16
• 主要材料16-18
• 實驗方法18-27
• 實驗結果27-30
• 討論30-33
• 參考文獻33-40
• 第二部分 乳腺癌耐藥細胞株轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pSUPER-siβ-arrestin 2通過抑制MDR1的表達來逆轉(zhuǎn)多藥耐藥40-58
• 前言40-41
• 主要材料41-43
• 實驗方法43-47
• 實驗結果47-52
• 討論52-55
• 參考文獻55-58
• 結論58-59
• 本研究的創(chuàng)新點及局限性59-60
• 致謝60-61
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄61-62
• 學位論文評閱及答辯情況表62-63
• 附件63-82

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本文編號：1046136