本文關(guān)鍵詞：SIRT1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用和機制研究

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【摘要】：轉(zhuǎn)移的發(fā)生是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。雖然研究人員對結(jié)直腸癌相關(guān)的遺傳改變做了廣泛的研究,但是至今仍不清楚結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移發(fā)生中的關(guān)鍵調(diào)控基因,這阻礙了轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者靶向治療的開展。作為一種NAD+依賴的去乙�；�,SIRT1兼具調(diào)節(jié)組蛋白和非組蛋白乙�；降幕钚浴＜韧难芯堪l(fā)現(xiàn)SIRT1在結(jié)直腸癌患者中異常高表達(dá),并且與患者病情的惡化和糟糕的整體生存期相關(guān);另外,相比于低轉(zhuǎn)移性的結(jié)直腸癌細(xì)胞系,SIRT1在高轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平要明顯更高。盡管這些結(jié)果提示SIRT1可能參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過程,但是SIRT1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的具體作用和潛在分子調(diào)控機制尚無報道。通過這項研究,我們希望能明確SIRT1在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中的作用,并闡明其相關(guān)分子機制,進而為臨床上使用SIRT1抑制劑治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌提供理論依據(jù)。具體實驗方法如下:(1)在低轉(zhuǎn)移性的SW480細(xì)胞系中外源表達(dá)SIRT1后,western blot實驗驗證SIRT1蛋白的表達(dá)變化,transwell實驗分析腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化。(2)在高轉(zhuǎn)移性的SW620、LoVo細(xì)胞系中干擾SIRT1后,western blot實驗驗證SIRT1蛋白的表達(dá)變化,Transwell實驗分析腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力的變化,劃痕實驗分析腫瘤細(xì)胞遷移能力的變化。(3)建立NOD/SCID小鼠結(jié)直腸癌移植瘤模型,研究干擾SIRT1對腫瘤轉(zhuǎn)移能力的影響。(4)通過qRT-PCR實驗研究干擾SIRT1后上皮標(biāo)志物E-cadherin、occludin及間質(zhì)標(biāo)志物fibronectin、vimentin mRNA表達(dá)水平的變化。通過western blot和免疫熒光實驗研究干擾SIRT1后上皮標(biāo)志物E-cadherin、occludin及間質(zhì)標(biāo)志物fibronectin、vimentin蛋白表達(dá)水平的變化。通過western blot實驗研究SIRT1特異性小分子抑制劑tenovin-6處理后,結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮標(biāo)志物E-cadherin、occludin及間質(zhì)標(biāo)志物vimentin蛋白表達(dá)的變化。(5)通過qRT-PCR、luciferase報告基因分析、western blot和免疫熒光等實驗研究干擾SIRT1后,Fra-1分別在mRNA、啟動子活性、蛋白表達(dá)水平的變化。(6)通過western blot和transwell等實驗研究Fra-1對SIRT1調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)發(fā)生的介導(dǎo)作用。(7)SIRT1和Fra-1在腫瘤組織樣本中的免疫組化及臨床相關(guān)性分析。結(jié)果顯示:(1)外源表達(dá)SIRT1促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲。(2)干擾SIRT1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲。(3)干擾SIRT1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)移。(4)干擾SIRT1促進結(jié)直腸癌細(xì)胞間質(zhì) 上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelialtransition,MET)的發(fā)生,表明SIRT1調(diào)控EMT。(5)干擾SIRT1下調(diào)Fra-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá),表明SIRT1調(diào)控Fra-1表達(dá)。(6)干擾Fra-1抑制SIRT1對EMT的調(diào)控作用,表明Fra-1介導(dǎo)SIRT1對EMT的調(diào)控。(7)SIRT1和Fra-1在結(jié)直腸癌患者中的高表達(dá)可預(yù)測其不良整體生存期。可見,SIRT1可通過調(diào)控Fra-1促進EMT的發(fā)生和結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移;因此,它是一個潛在的轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療靶點。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)直腸癌 轉(zhuǎn)移 SIRT1 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化 Fra-1
【學(xué)位授予單位】：浙江理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 縮略詞表9-13
• 1 引言13-16
• 1.1 結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移研究現(xiàn)狀13
• 1.2 SIRT1與腫瘤13-16
• 1.2.1 SIRT1分子概述13-14
• 1.2.2 SIRT1功能14
• 1.2.3 SIRT1與腫瘤14-16
• 1.2.3.1 SIRT1與腫瘤轉(zhuǎn)移14
• 1.2.3.2 SIRT1與結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移14-16
• 2 實驗儀器和材料16-21
• 2.1 主要儀器和耗材16-17
• 2.2 主要試劑及藥品17
• 2.3 主要抗體信息17-18
• 2.4 細(xì)胞系及培養(yǎng)條件18
• 2.5 主要溶液的配制18-20
• 2.6 反轉(zhuǎn)錄PCR引物設(shè)計與合成20-21
• 3 實驗方法21-33
• 3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代21
• 3.2 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、包裝和純化21-24
• 3.2.1 慢病毒表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建21
• 3.2.2 慢病毒包裝質(zhì)粒與表達(dá)質(zhì)粒的大量抽提21-22
• 3.2.3 慢病毒包裝22-23
• 3.2.4 慢病毒的收集和純化23
• 3.2.5 慢病毒的生物學(xué)滴度測定23
• 3.2.6 慢病毒的感染23-24
• 3.3 NOD/SCID小鼠體內(nèi)移植實驗24
• 3.4 免疫組化染色24-26
• 3.4.1 組織的石蠟包埋及切片24
• 3.4.2 石蠟切片的免疫組化24-25
• 3.4.3 目標(biāo)蛋白表達(dá)等級判定25-26
• 3.5 Transwell侵襲遷移實驗26
• 3.6 劃痕實驗26-27
• 3.7 qRT-PCR檢測基因mRNA水平表達(dá)差異27-28
• 3.7.1 總RNA的提取27
• 3.7.2 cDNA的制備27-28
• 3.7.3 實時PCR技術(shù)檢測目的基因mRNA水平表達(dá)28
• 3.8 免疫熒光檢測基因蛋白水平表達(dá)28-29
• 3.9 Western blot檢測基因蛋白水平表達(dá)29-31
• 3.9.1 收集蛋白29-30
• 3.9.2 SDS-PAGE電泳30
• 3.9.3 轉(zhuǎn)膜30-31
• 3.9.4 封閉31
• 3.9.5 孵育抗體31
• 3.9.6 顯影31
• 3.10 基因啟動子活性檢測31-32
• 3.11 統(tǒng)計學(xué)分析32-33
• 4 實驗結(jié)果與分析33-48
• 4.1 SIRT1對結(jié)直腸癌細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的影響33-36
• 4.1.1 SIRT1的內(nèi)源表達(dá)與結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移能力有關(guān)33-34
• 4.1.2 外源表達(dá)SIRT1促進結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲34-35
• 4.1.3 干擾SIRT1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外遷移和侵襲35-36
• 4.2 干擾SIRT1對結(jié)直腸癌細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響36-38
• 4.3 干擾SIRT1對結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT發(fā)生的影響38-41
• 4.4 SIRT1對Fra-1 的調(diào)控作用41-42
• 4.5 Fra-1 在SIRT1調(diào)控EMT中的介導(dǎo)作用42-44
• 4.6 SIRT1和Fra-1 在結(jié)直腸癌中的臨床病理學(xué)意義44-48
• 5 討論48-50
• 6 結(jié)論50-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 附錄58-59
• 攻讀碩士研究生期間的研究成果59-60
• 致謝60

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 尹亞飛;孫慧;馬杰;王桂葉;湯平;;SIRT1 mRNA在成人急性白血病骨髓細(xì)胞中的表達(dá)及其意義[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2009年03期

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本文編號：1041927