本文關(guān)鍵詞：體外多胺微環(huán)境對人肝癌細(xì)胞HepG2和SMMC-7721遷移的影響

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)背景:肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的一種惡性腫瘤,在全世界范圍內(nèi),亦是發(fā)病率和致死率最高的腫瘤之一,其致死率在腫瘤疾病中位居第三位。雖然近年來使用早期診斷、化療、放療和手術(shù)治療等方法使肝癌的療效有一定的提高,但是肝癌患者的預(yù)后仍不理想。多胺是一類帶正電荷的小分子脂肪族化合物,包括腐胺(putrescine,Put)、亞精胺或精脒(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm),是生命活動中不可或缺的生命物質(zhì),具有廣泛的生理及病理生理作用,如促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖、分化以及凋亡等。最近有文章顯示體內(nèi)多胺含量的變化和Akt1的高表達(dá)密切相關(guān),但是在肝癌中多胺和Akt1的生物學(xué)功能及分子機(jī)制仍然不清楚。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?多胺是一種帶正電荷的小分子脂肪族化合物,包括腐胺(putrescine,Put)、亞精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)。它廣泛存在于自然界中,例如:動植物細(xì)胞、細(xì)菌、原核細(xì)胞、酵母菌和病毒中都含有一定的多胺,它是大多數(shù)生命器官天然組份中所必需的。在正常生理情況下,多胺在人體組織和體液中的含量非常少;而在病變的腫瘤組織中多胺的含量明顯高于正常組織,并且腫瘤的生長、侵襲和遷移均與細(xì)胞內(nèi)多胺的含量有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過采用低、中、高三種不同濃度的多胺處理肝癌細(xì)胞,觀察多胺微環(huán)境對肝癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲等能力的影響,并探究其相關(guān)分子作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:選取人肝癌細(xì)胞Hep G2和SMMC-7721作為研究對象,首先用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)把Akt1基因轉(zhuǎn)入Hep G2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞中,將三種不同濃度的外源性多胺按低濃度(腐胺0.008 nmol/m L、精胺0.05 nmol/m L、精脒0.1nmol/m L)、中濃度(腐胺0.08nmol/m L、精胺0.5 nmol/m L、精脒1.0 nmol/m L)和高濃度(腐胺0.8 nmol/m L、精胺5.0 nmol/m L精脒10.0 nmol/m L)分別加入含定量培養(yǎng)基的Hep G2細(xì)胞、Hep G2-Akt1細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞和SMMC-7721-Akt1細(xì)胞中。每一種細(xì)胞都設(shè)陰性對照組,培養(yǎng)15天和30天。采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell遷移實(shí)驗(yàn)(未鋪膠)檢測不同濃度的多胺對四種細(xì)胞遷移能力的影響;采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度的多胺對四種細(xì)胞增殖能力的影響;采用蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)檢測Akt1、Akt、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)、鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarbo-xylase,ODC)、低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、P27kip1、整合素(Integrinα6)、精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等蛋白在不同濃度多胺微環(huán)境下的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:Hep G2細(xì)胞、Hep G2-Akt1細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞和SMMC-7721-Akt1細(xì)胞在不同濃度多胺微環(huán)境下表現(xiàn)出不同的增殖、侵襲和遷移能力,并且隨著多胺濃度的升高其增殖、侵襲和遷移能力逐漸增強(qiáng),并且表現(xiàn)出時間劑量依賴性。蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多胺可通過誘導(dǎo)鳥氨酸脫羧酶(ODC)、精脒/精胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(SSAT)、Akt1、整合素(Integrinα6)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP9)、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)等蛋白的表達(dá)上調(diào)以及下調(diào)P27kip1蛋白表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:高濃度多胺微環(huán)境促進(jìn)Hep G2細(xì)胞、Hep G2-Akt1細(xì)胞、SMMC-7721細(xì)胞和SMMC-7721-Akt1細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等能力,并且Hep G2-Akt細(xì)胞和SMMC-7721-Akt1細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力明顯高于Hep G2細(xì)胞和SMMC-7721細(xì)胞,表明Akt1于多胺微環(huán)境條件下在促進(jìn)腫瘤遷移的過程中發(fā)揮著重要作用。
【關(guān)鍵詞】：肝癌 多胺 Akt1 遷移 增殖
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-18
• 1 引言10-11
• 2 多胺在腫瘤中的研究11-14
• 2.1 多胺的生物功能11-12
• 2.2 多胺的代謝12-13
• 2.3 多胺與腫瘤13-14
• 3 Akt在腫瘤中的研究14-18
• 3.1 Akt的結(jié)構(gòu)14-15
• 3.2 Akt的功能15
• 3.3 Akt與腫瘤15-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料、試劑和儀器18-24
• 1 實(shí)驗(yàn)材料18
• 1.1 腫瘤細(xì)胞株18
• 1.2 Akt1高表達(dá)細(xì)胞株18
• 2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要溶液的配制18-21
• 2.1 實(shí)驗(yàn)試劑18-19
• 2.2 主要溶液的配制19-21
• 3 實(shí)驗(yàn)儀器21-24
• 第三章 實(shí)驗(yàn)方法24-32
• 1 細(xì)胞培養(yǎng)24-25
• 1.1 細(xì)胞株的復(fù)蘇24
• 1.2 細(xì)胞株的培養(yǎng)24
• 1.3 細(xì)胞多胺微環(huán)境下的培養(yǎng)24-25
• 2 Western Blot檢測蛋白的表達(dá)25-27
• 2.1 Western Blot檢測Akt1蛋白的表達(dá)25-27
• 2.2 Western Blot檢測侵襲、轉(zhuǎn)移蛋白的表達(dá)27
• 3 細(xì)胞遷移能力的檢測27-29
• 3.1 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)27-28
• 3.2 Transwell實(shí)驗(yàn)28-29
• 4 細(xì)胞單克隆形成實(shí)驗(yàn)29-30
• 5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析30-32
• 第四章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-50
• 1 Akt1高表達(dá)驗(yàn)證結(jié)果32
• 2 體外多胺微環(huán)境對細(xì)胞運(yùn)動能力的影響32-40
• 2.1 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-37
• 2.2 Transwell實(shí)驗(yàn)37-40
• 3 體外多胺微環(huán)境對細(xì)胞克隆形成能力的影響40-46
• 4 體外多胺微環(huán)境對轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的影響46-50
• 結(jié)論50-52
• 討論52-56
• 參考文獻(xiàn)56-62
• 附錄62-64
• 致謝64-65

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本文編號：1041966