發(fā)布時間：2017-10-15 16:27

  本文關(guān)鍵詞：丙酮酸激酶PKM2通過上調(diào)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT促進(jìn)肝細(xì)胞癌進(jìn)展

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【摘要】：目的丙酮酸激酶PKM2在惡性腫瘤代謝方面起著重要作用,其介導(dǎo)的Warburg效應(yīng)可以為腫瘤細(xì)胞的快速增殖提供足夠的能量和大量的代謝中間產(chǎn)物。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT在大多數(shù)惡性腫瘤中具有活性并賦予細(xì)胞無限增殖的能力。本研究目的在于研究丙酮酸激酶PKM2在肝癌細(xì)胞增殖過程中的功能,探究PKM2與人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT的關(guān)系,并進(jìn)一步闡明PKM2調(diào)節(jié)hTERT的分子機制。方法1.細(xì)胞增殖能力檢測：在肝癌細(xì)胞HepG2中轉(zhuǎn)染陰性對照或PKM2 siRNA后72h分別計數(shù)300個細(xì)胞進(jìn)行克隆形成實驗,培養(yǎng)10天后結(jié)晶紫染色,觀察克隆形成數(shù)目變化。在干擾PKM2后分別在24h、48h、72h時通過CCK-8實驗檢測細(xì)胞活性,檢測PKM2干擾對細(xì)胞增殖的影響。2.PKM2與hTERT的聯(lián)系在HepG2中轉(zhuǎn)染陰性對照或PKM2 siRNA72h后,分別提取RNA和蛋白,qRT-PCR檢測PKM2mRNA干擾效果、hTERTmRNA表達(dá)情況,Western Blotting檢測PKM2蛋白干擾效果,ELISA檢測端粒酶活性。構(gòu)建野生型hTERT核心啟動子活性報告質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)入陰性對照或PKM2 siRNA 24h后轉(zhuǎn)入內(nèi)參海腎熒光素表達(dá)質(zhì)粒TK,同時轉(zhuǎn)入hTERT啟動子報告質(zhì)粒,48h后檢測螢火蟲熒光和海腎熒光,檢測PKM2干擾對hTERT啟動子活性的影響。3.PKM2調(diào)控hTERT分子機制轉(zhuǎn)入陰性對照或PKM2 siRNA72h后,檢測Sp1在mRNA水平和蛋白水平的變化,ChIP檢測干擾PKM2后SP1與hTERT啟動子區(qū)域結(jié)合的變化。構(gòu)建hTERT啟動子區(qū)域SP1結(jié)合位點單位點突變型啟動子報告質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)入PKM2siRNA 24h后轉(zhuǎn)入TK和突變型質(zhì)粒,檢測螢火蟲熒光和海腎熒光。4.PKM1與hTERT的關(guān)系以及分子調(diào)控機制在HepG2中轉(zhuǎn)染陰性對照或PKM1siRNA 72h后,轉(zhuǎn)染空載質(zhì)�；騊KM1表達(dá)質(zhì)粒48h后,分別提取細(xì)胞RNA和蛋白,在mRNA和蛋白水平檢測PKM1表達(dá)情況,在mRNA水平檢測hTERT、轉(zhuǎn)錄因子Sp1的變化,以及在mRNA和蛋白水平檢測另一個經(jīng)典hTERT轉(zhuǎn)錄因子c-Myc和上游分子β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)果1.在肝癌細(xì)胞HepG2中干擾PKM2后,細(xì)胞克隆形成能力降低,CCK-8實驗證明PKM2干擾組活細(xì)胞數(shù)比陰性對照組少,證明降低PKM2抑制肝癌細(xì)胞HepG2的增殖能力。2.干擾PKM2后hTERT轉(zhuǎn)錄水平下降,其啟動子活性、mRNA表達(dá)、端粒酶活性均降低。3.干擾PKM2后hTERT主要轉(zhuǎn)錄因子Sp1在mRNA、蛋白水平表達(dá)均降低,hTERT啟動子SP1結(jié)合位點單位點突變后部分逆轉(zhuǎn)PKM2對hTERT啟動子活性的調(diào)節(jié)作用,ChIP實驗結(jié)果表明干擾PKM2后SP1與hTERT啟動子序列結(jié)合減少。4.干擾PKM1后hTERT mRNA水平上升,轉(zhuǎn)錄因子Sp1 mRNA水平無明顯變化,而c-Myc和其上游調(diào)控因子P-catenin表達(dá)升高,高表達(dá)PKM1后hTERT mRNA水平降低,c-Myc和P-catenin表達(dá)也降低。結(jié)論1.PKM2促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖。2.PKM2正向調(diào)節(jié)hTERT轉(zhuǎn)錄活性,并且通過影響其上游轉(zhuǎn)錄因子SP1與hTERT啟動子的結(jié)合來調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。3.PKM1負(fù)向調(diào)控hTERT mRNA表達(dá)水平,并且可能通過β-catenin-c-Myc信號途徑調(diào)節(jié)hTERT表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：PKM2 hTERT SP1 PKM1
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 符號說明11-12
• 前言12-18
• 實驗材料18-22
• 實驗方法22-36
• 實驗結(jié)果36-44
• 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 附表47-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-55
• 發(fā)表論文55-56
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表56

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本文編號：1038143