本文關(guān)鍵詞：Rorβ與Nrip2相互作用調(diào)控胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的研究

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【摘要】：研究背景 胃癌是我國常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率在我國位居第二,死亡率排第三。目前對胃癌的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明。胃癌的發(fā)生起源于胃上皮干細(xì)胞,是一種干細(xì)胞疾病。正常胃上皮干細(xì)胞發(fā)生基因突變或雜合性缺失形成腫瘤干細(xì)胞進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。胃癌組織中存在少量的腫瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞,這些細(xì)胞具有無限自我更新、多向分化和較強(qiáng)的增殖潛能,正是這些胃癌干細(xì)胞促進(jìn)了胃癌的浸潤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),是胃癌患者預(yù)后差的主要原因之一。然迄今對胃癌干細(xì)胞參與浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制有待深入,闡明其浸潤轉(zhuǎn)移機(jī)制對預(yù)警和阻斷胃癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移具有重要意義。上皮間質(zhì)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)是腫瘤干細(xì)胞的重要表型特征之一,EMT即上皮細(xì)胞在各種因素的作用下,失去細(xì)胞極性,向間質(zhì)樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化并獲得侵襲和遷移能力的過程。EMT是腫瘤重要的惡性生物學(xué)行為之一,腫瘤細(xì)胞通過EMT浸潤和遷移能力增強(qiáng)從而促進(jìn)轉(zhuǎn)移,在胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤的原發(fā)性浸潤和繼發(fā)性轉(zhuǎn)移中起著重要作用。探討EMT調(diào)控機(jī)制對腫瘤細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移靶向治療有著重要的價值。 在先前研究中,我們通過構(gòu)建大腸癌干細(xì)胞樣細(xì)胞cDNA重組逆轉(zhuǎn)錄病毒文庫等方法,發(fā)現(xiàn)了新分子Nrip2,它能促進(jìn)大腸癌干細(xì)胞的自我更新,Rorβ是其關(guān)鍵作用靶蛋白。作為孤兒核受體家族的一員,Rorβ主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng),尤其是調(diào)控生理節(jié)律的視交叉上核,視網(wǎng)膜和松果體腺,近來隨著檢測技術(shù)靈敏度的增加,發(fā)現(xiàn)Rorβ在神經(jīng)系統(tǒng)外組織如正常骨組織、胰腺和子宮內(nèi)膜癌及子宮平滑肌肉瘤中也表達(dá)。我們通過mRNA FISH和qPCR方法檢測發(fā)現(xiàn)Rorβ在正常大腸上皮和大腸癌細(xì)胞中亦表達(dá)；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Nrip2/Rorβ/HBP1分子間的相互作用通過影響Wnt通路活性而調(diào)控大腸癌自我更新。然而Rorβ在胃癌細(xì)胞中的作用尚不清楚。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究擬在先前研究基礎(chǔ)上,探討Rorβ對胃癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響,研究Rorβ和Nrip2對胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的調(diào)控作用并檢測兩者之間的相互作用。 實(shí)驗(yàn)方法 1.檢測Rorβ的表達(dá)：我們用免疫組化染色和TaqMan(?) Real-time PCR方法分別檢測Rorβ在胃癌組織中的表達(dá),并分析其與胃癌分期的相關(guān)性。 2. Rorβ基因富集分析：200例胃癌組織分成Rorβ高表達(dá)組和低表達(dá)組,進(jìn)一步進(jìn)行基因富集GSEA分析。 3.表達(dá)Rorβ對Wnt通路的影響：將質(zhì)粒Rorβ-pReceiver瞬時表達(dá)胃癌SGC7901細(xì)胞后通過雙熒光報告基因和Western Blot方法檢測Wnt通路的活性。 4.EMT轉(zhuǎn)錄因子的檢測：將Rorβ-pEGFP-C1、Nrip2-pEGFP-C1和Nrip2T152A重組質(zhì)粒,分別瞬時轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞后,Western Blot檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。 5.細(xì)胞定位：將Nrip2-pEGFP-C1和Rorβ-pEGFP-C1重組質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞,轉(zhuǎn)染24h在共聚焦顯微鏡下觀察及轉(zhuǎn)染48h核漿分離后用Western Blot檢測兩者在細(xì)胞中的定位。 6.檢測Nrip2和Rorβ蛋白之間的相互作用：將Rorβ-2A-Peptide-Nrip2/pCMV重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染胃癌SGC7901細(xì)胞,核漿分離后用Western Blot檢測Rorβ的表達(dá)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.Rorβ在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)：經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)Rorβ蛋白在胃癌組織較正常幽門腺組織表達(dá)下調(diào),Real-time PCR亦發(fā)現(xiàn)Rorβ mRNA在胃癌組織較癌旁組織表達(dá)下調(diào),然其表達(dá)與胃癌TNM分期相關(guān)性不明顯。 2. Rorβ促進(jìn)細(xì)胞分化：200例胃癌組織基因富集分析發(fā)現(xiàn)Rorβ高表達(dá)組較低表達(dá)組CD44、ALDH1、ALCAM/CD166等表達(dá)下調(diào)。 3.過表達(dá)Rorβ能抑制Wnt通路活性。 4. Rorp抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)：慢病毒感染Nrip2的SGC7901細(xì)胞顯微鏡下發(fā)現(xiàn)其形態(tài)發(fā)生改變；過表達(dá)Rorβ的細(xì)胞Snail/Slug蛋白表達(dá)下調(diào),而過表達(dá)野生型Nrip2的細(xì)胞Snail/Slug、Zeb1蛋白表達(dá)上調(diào),然第152位磷酸化位點(diǎn)突變后能消除野生型Nrip2對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)效應(yīng)。 5.細(xì)胞定位：免疫熒光染色和Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)Nrip2主要分布在胞漿,而Rorβ則分布在胞核。 6. Nrip2與Rorβ的相互作用：共轉(zhuǎn)染Nrip2和Rorβ后,發(fā)現(xiàn)Rorβ被顯著“扣留”在胞漿。 結(jié)論：在胃癌組織中Rorβ表達(dá)下調(diào),過表達(dá)Rorβ能下調(diào)胃癌細(xì)胞Wnt通路活性和抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),Nrip2與Rorβ的相互作用減弱了Rorβ對胃癌細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的抑制效應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：胃癌 Nrip2 Rorβ Wnt通路 EMT
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.2
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文縮略詞12-13
• 目錄13-14
• 引言14-17
• 1. 材料17-20
• 2. 方法20-30
• 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-37
• 4. 討論37-41
• 5. 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-45
• 綜述45-63
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 作者簡歷及在學(xué)期間取得的科研成果63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1037885