本文關(guān)鍵詞：靶向腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞組織因子的免疫治療研究

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【摘要】：腫瘤基因治療是通過(guò)功能性治療基因的導(dǎo)入,利用基因的產(chǎn)物來(lái)對(duì)付癌變細(xì)胞和組織,達(dá)到治療目的。建立一個(gè)安全有效能特異性靶向腫瘤部位的基因治療體系是腫瘤基因治療研究的熱點(diǎn)。組織因子(tissue factor,TF)在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá),也在一些類(lèi)型的惡性腫瘤細(xì)胞上有表達(dá),而在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá),因此可以作為特異性治療腫瘤的靶點(diǎn)。與TF能特異性結(jié)合的凝血酶因子FⅦ,由一條20 kD輕鏈和一條30 kD的重鏈通過(guò)二硫鍵連接而成,輕鏈負(fù)責(zé)靶向和TF結(jié)合,重鏈負(fù)責(zé)凝血功能,小鼠的FⅦ輕鏈(mouse light chain of FⅦ, mLFⅦ)可以緊密的與人和小鼠的TF結(jié)合,而人的FⅦ輕鏈(human light chain of FⅦ,hLFⅦ只能和人的TF結(jié)合與小鼠的TF結(jié)合不緊密。因此,可以將小鼠FⅦ輕鏈部分作為一個(gè)具有靶向功能的原件用于靶向腫瘤治療。IgG在體內(nèi)分布廣泛,是血液和組織液中含量最高的免疫球蛋白,該蛋白通過(guò)N端可變區(qū)Fab段識(shí)別和結(jié)合抗原,C端恒定區(qū)Fc段結(jié)合表達(dá)Fc受體的細(xì)胞(FcR細(xì)胞),引發(fā)抗原(如腫瘤細(xì)胞、病毒感染細(xì)胞或細(xì)菌)被FcR細(xì)胞清除。由于可變區(qū)與抗原的結(jié)合是特異性的、而Fc段所引發(fā)的免疫效應(yīng)是非特異性的,因此,將IgG的抗原識(shí)別區(qū)換成特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的分子而保留Fc段,所構(gòu)建的新蛋白質(zhì)就可以引發(fā)機(jī)體的免疫系統(tǒng)來(lái)特異性殺傷腫瘤細(xì)胞。本文以TF為靶點(diǎn),以mLFⅦ為靶向分子,以IgG1抗體Fc段為效應(yīng)分子,構(gòu)建了“靶向+效應(yīng)”的融合基因治療體系。第一、為了研究mLFⅦ的靶向性,構(gòu)建了能表達(dá)mLFⅦ-E2的紅色熒光融合蛋白和能表達(dá)mLFⅦ-YFP勺黃色熒光融合蛋白示蹤質(zhì)粒：pSCIgκ-mLFⅦ-E2, pSCIgK-mLFⅦ-YFP。第二、構(gòu)建了能表達(dá)mLFⅦ和IgG1抗體Fc段的融合蛋白治療質(zhì)粒：pSCIgκ-mLFⅦ-Fc。第三、為了清晰直觀的觀測(cè)基因治療效果,構(gòu)建了發(fā)綠色熒光的人肝癌SK-Hep-1-G裸鼠皮下腫瘤模型。第四、為了檢測(cè)TF的含量對(duì)腫瘤治療效果是否有影響,構(gòu)建了TF高表達(dá)的人肺癌NCI-H292裸鼠皮下腫瘤模型和TF低表達(dá)的人肺癌A549裸鼠皮下腫瘤模型。L64/電擊結(jié)合的基因傳遞方法是一種安全有效的肌肉基因傳遞方法,所以我們利用L64/電擊結(jié)合的基因傳遞方法將構(gòu)建好的質(zhì)粒注射至裸鼠模型的脛骨前肌部位并傳遞進(jìn)入肌肉細(xì)胞,利用肌肉細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白在信號(hào)肽的作用下分泌至細(xì)胞外,經(jīng)過(guò)血液循環(huán),在mLFⅦ的引導(dǎo)下靶向結(jié)合到腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的組織因子TF上,效應(yīng)分子Fc與表達(dá)Fc受體的免疫細(xì)胞結(jié)合并活化補(bǔ)體功能,導(dǎo)致腫瘤新生血管的破壞和腫瘤組織的清除。實(shí)驗(yàn)研究表明,該基因治療體系能明顯治療含有TF因子的腫瘤尤其是高表達(dá)TF的腫瘤的生長(zhǎng).
【關(guān)鍵詞】：TF FⅦ Fc 腫瘤基因治療 L64 電脈沖
【學(xué)位授予單位】：西南交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R730.51
【目錄】：

• 縮略詞表6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 緒論14-26
• 1.1 腫瘤的發(fā)病機(jī)制14
• 1.2 腫瘤基因治療的載體14-17
• 1.2.1 病毒載體14-15
• 1.2.2 非病毒載體15-17
• 1.3 腫瘤基因治療的方法17-20
• 1.3.1 基因沉默治療17
• 1.3.2 免疫基因治療17-18
• 1.3.3 抑癌基因和腫瘤轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)基因治療18-19
• 1.3.4 抑制血管生成治療19-20
• 1.4 腫瘤基因治療存在的問(wèn)題及解決辦法20-22
• 1.4.1 基因轉(zhuǎn)染的效率及載體的安全性問(wèn)題20-21
• 1.4.2 治療基因單一問(wèn)題及其解決途徑21-22
• 1.5 TF,Fc和FⅦ因子在腫瘤基因治療中的應(yīng)用22-24
• 1.5.1 TF因子22-23
• 1.5.2 IgG抗體Fc段23
• 1.5.3 FⅦ因子23-24
• 1.6 課題的提出及研究目的24-26
• 第二章 TF靶向融合質(zhì)粒的構(gòu)建26-46
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-38
• 2.2.1 E2,YFP,mLFⅦ片段的PCR擴(kuò)增27-29
• 2.2.2 目的質(zhì)粒的構(gòu)建29-35
• 2.2.3 重組子的鑒定35-37
• 2.2.4 質(zhì)粒提取37-38
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-44
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增E2,YFP,mLFⅦ片段38-39
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的酶切和PCR鑒定39-44
• 2.4 小結(jié)44-46
• 第三章 TF靶向融合質(zhì)粒在人肝癌SK-Hep-1-G裸鼠腫瘤模型中的研究46-53
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器46-47
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 3.2.1 SK-Hep-1細(xì)胞表面TF因子含量測(cè)定47
• 3.2.2 SK-Hep-1-G裸鼠皮下腫瘤模型的建立47-48
• 3.2.3 SK-Hep-1-G裸鼠皮下腫瘤的基因治療及活體成像分析48
• 3.2.4 mLFⅦ在裸鼠SK-Hep-1-G細(xì)胞腫瘤模型中靶向性分析48
• 3.2.5 腫瘤血管密度的檢測(cè)48-49
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-52
• 3.3.1 SK-Hep-1細(xì)胞TF含量的檢測(cè)49-50
• 3.3.2 mLFⅦ在人肝癌SK-Hep-1-G細(xì)胞裸鼠腫瘤模型中靶向性50
• 3.3.3 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc質(zhì)粒對(duì)SK-Hep-1-G裸鼠皮下腫瘤的治療50-52
• 3.3.4 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc質(zhì)粒對(duì)腫瘤血管的作用52
• 3.4 小結(jié)52-53
• 第四章 TF因子的表達(dá)量對(duì)治療效果的影響研究53-67
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器53
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法53-55
• 4.2.1 人肺癌A549/NCI-H292細(xì)胞表面TF因子含量測(cè)定53-54
• 4.2.2 A549/NCI-H292裸鼠皮下腫瘤模型的建立54
• 4.2.3 A549/NCI-H292裸鼠皮下腫瘤的基因治療54
• 4.2.4 mLFⅦ在裸鼠A549/NCI-H292細(xì)胞腫瘤模型中靶向性分析54
• 4.2.5 A549/NCI-H292裸鼠皮下腫瘤的基因治療檢測(cè)54
• 4.2.6 A549/NCI-H292裸鼠皮下腫瘤血管密度的檢測(cè)54
• 4.2.7 pSCIgK-mLFⅦ-Fc基因治療體系對(duì)A549/NCI-H292裸鼠腫瘤血流量的影響54
• 4.2.8 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc基因治療體系體內(nèi)安全性的檢測(cè)54-55
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果55-66
• 4.3.1 A549/NCI-H292細(xì)胞TF含量的檢測(cè)55-56
• 4.3.2 mLFⅦ在人肺癌A549/NCI-H292細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤模型中靶向性分析56-58
• 4.3.3 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc質(zhì)粒對(duì)人肺癌A549/NCI-H292細(xì)胞裸鼠皮下腫瘤的治療58-61
• 4.3.4 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc質(zhì)粒對(duì)A549/NCI-H292腫瘤血管的作用61-63
• 4.3.5 pSCIgκ-mLFⅦ-Fc質(zhì)�；蛑委燇w系體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)63-66
• 4.4 小結(jié)66-67
• 結(jié)論67-68
• 致謝68-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的論文及科研成果77

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