本文關(guān)鍵詞：線粒體動力相關(guān)蛋白1在含笑內(nèi)酯誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:研究線粒體動力相關(guān)蛋白1(Dynamin-related protein 1,Drp1)在含笑內(nèi)酯(Micheliolide,MCL)誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡過程中的作用及可能涉及的分子機(jī)制。方法:重組質(zhì)粒載體PCDH-p EGFP、PCDH-p EGFP-Drp1-K38A(Drp1突變體)及PCDH-p EGFP-Drp1-WT(Drp1野生型)轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒,構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)EGFP、Drp1-K38A、Drp1-WT的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株;免疫蛋白印跡法(Western Blot)檢測目的蛋白Drp1的表達(dá)水平;激光聚焦顯微鏡觀察MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞線粒體形態(tài);顯微鏡下觀察MCL對乳腺癌細(xì)胞形態(tài)的影響;Hochest33342染色檢測乳腺癌細(xì)胞核形態(tài)改變;MTT比色法檢測MCL對乳腺癌細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測Annexin V-PE染色后細(xì)胞凋亡情況。JC-1染色熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化;Western Blot檢測細(xì)胞色素C釋放及PARP蛋白裂解;流式細(xì)胞術(shù)檢測Mito SOX染色后細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平;MTT比色法檢測抗氧化劑NAC(N-乙酰半胱氨酸,N-acetyl-L-cysteine)對MCL抑制MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果:1.MCL可劑量依賴性抑制MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖,同時(shí)MCL可上調(diào)Drp1蛋白表達(dá)水平,促進(jìn)線粒體片段化分裂。2.獲得外源性EGFP、Drp1-K38A及Drp1-WT穩(wěn)定過表達(dá)的MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株,激光共聚焦顯微鏡下觀察Drp1-WT組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞線粒體片段化比例較Drp1-K38A、EGFP組細(xì)胞明顯增多(P0.05)。3.顯微鏡下觀察MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞形態(tài)變化,隨MCL濃度增加,MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞逐漸縮小變圓,細(xì)胞膜邊界不清、胞膜破裂、細(xì)胞固縮死亡,與Drp1-K38A、EGFP組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞相比,Drp1-WT組出現(xiàn)上述細(xì)胞形態(tài)變化更明顯。熒光顯微鏡觀察Hoechest33342染色的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞核形態(tài)改變,與Drp1-K38A、EGFP組相比,Drp1-WT組的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)出較多的核固縮及碎裂。4.MTT結(jié)果顯示:MCL處理MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞48h,Drp1-WT組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞增殖率較Drp1-K38A及EGFP組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞增殖率明顯降低(P0.05)。5.細(xì)胞凋亡染色流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞24h,Drp1-WT組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率較Drp1-K38A及EGFP組明顯增高(P0.05)。6.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的變化,10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞24h,Drp1-WT組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯高于表達(dá)Drp1-K38A及EGFP組(P0.05)。7.熒光顯微鏡下觀察各組線粒體膜電位變化:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞24h,Drp1-WT組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位水平較Drp1-K38A及EGFP組明顯降低(P0.05)。8.凋亡相關(guān)蛋白檢測:Western Blot結(jié)果顯示:10μM MCL作用MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞24h,Drp1-WT組的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞色素C表達(dá)水平及PARP蛋白裂解片段表達(dá)較Drp1-K38A及EGFP組明顯增高。9.應(yīng)用抗氧化劑NAC后,各組MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞對MCL敏感性明顯下降,Drp1-WT組的MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞與Drp1-K38A及EGFP組細(xì)胞增殖率相比無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:MCL可劑量依賴性抑制MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞增殖,其機(jī)制與MCL誘導(dǎo)線粒體動力相關(guān)蛋白1表達(dá),促進(jìn)線粒體分裂,提高乳腺癌細(xì)胞ROS水平,耗散線粒體膜電位,促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放,裂解凋亡蛋白PARP,進(jìn)而誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：含笑內(nèi)酯 線粒體動力相關(guān)蛋白1 乳腺癌細(xì)胞 線粒體 凋亡
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-11
• 前言11-14
• 研究現(xiàn)狀、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 對象和方法14-25
• 1.1 材料與儀器14
• 1.2 試劑配制14-15
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法15-25
• 1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)15-16
• 1.3.2 慢病毒法建立穩(wěn)定乳腺癌細(xì)胞株16-19
• 1.3.3 Western blot檢測Drp1蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平19-21
• 1.3.4 激光共聚焦檢測細(xì)胞線粒體形態(tài)21
• 1.3.5 光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)21-22
• 1.3.6 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖22-23
• 1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡23
• 1.3.8 JC-1 染色觀察細(xì)胞線粒體膜電位23-24
• 1.3.9 MitoSOX Red染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（ROS）24
• 1.3.10 統(tǒng)計(jì)方法24-25
• 結(jié)果25-43
• 2.1 MCL對MCF-7 細(xì)胞增殖的影響25-26
• 2.2 MCL上調(diào)Drp1蛋白表達(dá)水平并促進(jìn)線粒體片段化分裂26-27
• 2.3 Drp1-WT及Drp1-K38A慢病毒包裝鑒定27-29
• 2.4 建立過表達(dá)Drp1-WT及Drp1-K38A基因的乳腺癌細(xì)胞株29
• 2.5 Drp1-WT對細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響29-31
• 2.6 Drp1促進(jìn)MCL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核改變31-33
• 2.7 Drp1增強(qiáng)MCL對乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用33-35
• 2.8 Drp1增強(qiáng)MCL對乳腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用35-36
• 2.9 Drp1增強(qiáng)MCL誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚36-38
• 2.10 Drp1促進(jìn)MCL對乳腺癌細(xì)胞線粒體膜電位耗散作用38-39
• 2.11 Drp1促進(jìn)MCL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞釋放細(xì)胞色素C及裂解PARP蛋白39-40
• 2.12 抗氧化劑NAC逆轉(zhuǎn)MCL對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用40-42
• 2.13 Drp1在MCL誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制分析42-43
• 討論43-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 綜述 Drp1生物學(xué)功能與腫瘤54-69
• 綜述參考文獻(xiàn)61-69
• 致謝69

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本文編號：1029370