本文關(guān)鍵詞：尼古丁對(duì)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞及肺癌細(xì)胞株A549生物學(xué)特性影響的研究

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【摘要】：目的:通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討不同濃度的尼古丁對(duì)人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)以及肺癌細(xì)胞株A549生物學(xué)特性的影響來(lái)說(shuō)明其對(duì)人體的潛在危害,以期完善尼古丁、間質(zhì)干細(xì)胞和腫瘤之間的關(guān)系,為預(yù)防和治療吸煙相關(guān)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)采用貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSC,利用形態(tài)學(xué)特征、成骨成脂多向分化潛能和相關(guān)基因表達(dá)以及表面抗原標(biāo)記的檢測(cè)對(duì)其進(jìn)行鑒定。(2)利用MTT法檢測(cè)尼古丁對(duì)hUC-MSC增殖能力的影響,通過(guò)濃度梯度篩選出0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.3mg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用濃度;Transwell實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)不同濃度的尼古丁對(duì)hUC-MSC遷移能力的影響;流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)尼古丁對(duì)hUC-MSC周期和凋亡的影響;Western blot和免疫熒光檢測(cè)不同濃度的尼古丁對(duì)hUC-MSC相關(guān)蛋白的表達(dá)。(3)用0.3mg/ml的尼古丁預(yù)處理hUC-MSC 24 h后與肺癌細(xì)胞株A549共培養(yǎng)24 h。(4)通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)共培養(yǎng)后的肺癌細(xì)胞株A549的遷移能力。(5)用共培養(yǎng)后的肺癌細(xì)胞株A549進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)共培養(yǎng)后的細(xì)胞的致瘤能力。(6)對(duì)瘤體進(jìn)行HE染色和免疫組化分析。結(jié)果:(1)從臍帶組織塊中成功分離出一類(lèi)呈漩渦樣生長(zhǎng)的長(zhǎng)梭形細(xì)胞;經(jīng)過(guò)傳代純化后,能夠誘導(dǎo)成為成骨和脂肪細(xì)胞,并分別表達(dá)相應(yīng)的基因;流式細(xì)胞鑒定符合hUC-MSC表面標(biāo)記。(2)MTT結(jié)果表明尼古丁能夠抑制hUC-MSC的增殖,并呈濃度和時(shí)間依賴(lài)性,當(dāng)尼古丁的濃度在0.1mg/ml到0.3mg/ml之間,不會(huì)抑制hUC-MSC的增殖;隨著尼古丁濃度的不斷增大,hUC-MSC的遷移能力在增強(qiáng);流式細(xì)胞分析顯示經(jīng)過(guò)不同濃度的尼古丁處理后的hUC-MSC重阻滯在S期,細(xì)胞凋亡數(shù)量也隨之增加;Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達(dá)降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin等EMT相關(guān)蛋白表達(dá)均升高,Sox2、Nanog、Sall4、Oct4等干性相關(guān)蛋白表達(dá)也都有不同程度的升高,Cyclin D1、Cyclin D3等周期相關(guān)蛋白表達(dá)也均有升高。(3)Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)顯示在共培養(yǎng)的條件下,實(shí)驗(yàn)組的肺癌細(xì)胞株A549遷移能力比對(duì)照組的要強(qiáng);裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞成瘤的速度、腫瘤的大小、體積和質(zhì)量均高于對(duì)照組;HE和免疫組化染色顯示實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的細(xì)胞排列更加紊亂、高度異型性、核漿比升高、出現(xiàn)病理性核分裂象以及PCNA表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論:(1)在體外培養(yǎng)條件下,尼古丁能夠增強(qiáng)hUC-MSC的遷移能力和干性。(2)經(jīng)尼古丁預(yù)處理的hUC-MSC與肺癌細(xì)胞株A549共培養(yǎng)后,使得A549有更強(qiáng)的遷移能力、惡性程度以及體內(nèi)致瘤能力。
【關(guān)鍵詞】：尼古丁 間質(zhì)干細(xì)胞 A549 共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮略詞中英文注釋表14-15
• 第一章 緒論15-23
• 1.1. 概述15-16
• 1.2. 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞16-21
• 1.2.1. 干細(xì)胞16
• 1.2.2. 間質(zhì)干細(xì)胞16-17
• 1.2.3. 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞17-18
• 1.2.4. 間質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定18-19
• 1.2.5. 間質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用19-20
• 1.2.6. 間質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤20-21
• 1.2.7. 間質(zhì)干細(xì)胞與毒理學(xué)研究21
• 1.3. 尼古丁21-23
• 1.3.1. 尼古丁概述21-22
• 1.3.2. 尼古丁和間質(zhì)干細(xì)胞22
• 1.3.3. 尼古丁與腫瘤的研究22-23
• 第二章 研究目的、方法、方案及意義23-26
• 2.1. 研究目的23
• 2.2. 研究方法23-24
• 2.3. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案24-25
• 2.3.1. 間質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定24
• 2.3.2. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響24-25
• 2.3.3. 尼古丁處理后的間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)A549生物特性的影響25
• 2.4. 研究意義25-26
• 第三章 間質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定26-39
• 3.1. 試劑材料與儀器26-27
• 3.1.1. 標(biāo)本來(lái)源26
• 3.1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材26-27
• 3.1.3. 實(shí)驗(yàn)儀器27
• 3.2. 相關(guān)溶液的配制27-28
• 3.2.1. L-DMEM培養(yǎng)液（1000 ml）27-28
• 3.2.2. 雙抗的配制28
• 3.2.3. 0.25%胰酶的配制（1000 ml）28
• 3.2.4. PBS的配制（1000 ml）28
• 3.2.5. 凍存液的配制(10 ml)28
• 3.3. 實(shí)驗(yàn)方法28-33
• 3.3.1. 細(xì)胞的原代分離培養(yǎng)28-29
• 3.3.2. 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)29
• 3.3.3. 細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇29-30
• 3.3.4. 細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定30
• 3.3.5. 細(xì)胞多向分化潛能鑒定30-33
• 3.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-36
• 3.4.1. 細(xì)胞分離培養(yǎng)和鑒定33-34
• 3.4.2. 細(xì)胞多向分化潛能鑒定34-35
• 3.4.3. 細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定35-36
• 3.5. 討論36-39
• 第四章 尼古丁對(duì)臍帶間質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響39-52
• 4.1. 試劑材料與儀器39-40
• 4.1.1. 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材39
• 4.1.2. 實(shí)驗(yàn)儀器39-40
• 4.2. 相關(guān)溶液的配制40-41
• 4.2.1. MTT的配制40
• 4.2.2. 不同濃度的尼古丁的配制40
• 4.2.3. Western-blot相關(guān)試劑的配制40-41
• 4.3. 實(shí)驗(yàn)方法41-44
• 4.3.1. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響41
• 4.3.2. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的影響41
• 4.3.3. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞周期和凋亡的影響41-42
• 4.3.4. 細(xì)胞蛋白的提取42
• 4.3.5. Western-blot42-43
• 4.3.6. 免疫熒光43
• 4.3.7. 統(tǒng)計(jì)分析43-44
• 4.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果44-50
• 4.4.1. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞增殖和形態(tài)的影響44-45
• 4.4.2. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞遷移能力的影響45-46
• 4.4.3. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞周期的影響46-47
• 4.4.4. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞凋亡的影響47-48
• 4.4.5. 尼古丁對(duì)間質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響48-50
• 4.5. 討論50-52
• 第五章 尼古丁處理后的臍帶間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞株A549生物特性的影響52-63
• 5.1. 試劑材料與儀器52-53
• 5.1.1. 肺癌細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)裸鼠52
• 5.1.2. 實(shí)驗(yàn)試劑和耗材52
• 5.1.3. 實(shí)驗(yàn)儀器52-53
• 5.2. 相關(guān)溶液的配制53
• 5.2.1. 抗原修復(fù)液的配制53
• 5.2.2. 免疫組化專(zhuān)用PBS的配制53
• 5.3. 實(shí)驗(yàn)方法53-56
• 5.3.1. 間質(zhì)干細(xì)胞與A549共培養(yǎng)體系的建立53-54
• 5.3.2. Transwell遷移實(shí)驗(yàn)54
• 5.3.3. 劃痕實(shí)驗(yàn)54
• 5.3.4. 平板克隆實(shí)驗(yàn)54-55
• 5.3.5. 裸鼠皮下致瘤55
• 5.3.6. 組織切片HE染色55
• 5.3.7. 免疫組化55-56
• 5.3.8. 統(tǒng)計(jì)分析56
• 5.4. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果56-61
• 5.4.1. 共培養(yǎng)下對(duì)A549遷移能力的影響56-58
• 5.4.2. 共培養(yǎng)下對(duì)A549克隆形成能力的影響58-59
• 5.4.3. 共培養(yǎng)促進(jìn)A549體內(nèi)生長(zhǎng)59-60
• 5.4.4. 腫瘤組織病理切片分析60-61
• 5.5. 討論61-63
• 第六章 主要結(jié)論與展望63-64
• 6.1. 主要結(jié)論63
• 6.2. 展望63-64
• 參考文獻(xiàn)64-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文、獲獎(jiǎng)及參加會(huì)議75
• 一、發(fā)表論文情況75
• 二、獲獎(jiǎng)情況75
• 三、參加會(huì)議情況75

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