本文關(guān)鍵詞：尼古丁對人臍帶間質(zhì)干細胞及肺癌細胞株A549生物學特性影響的研究

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【摘要】：目的:通過實驗探討不同濃度的尼古丁對人臍帶間質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hUC-MSC)以及肺癌細胞株A549生物學特性的影響來說明其對人體的潛在危害,以期完善尼古丁、間質(zhì)干細胞和腫瘤之間的關(guān)系,為預防和治療吸煙相關(guān)疾病提供實驗依據(jù)。方法:(1)采用貼壁法分離培養(yǎng)hUC-MSC,利用形態(tài)學特征、成骨成脂多向分化潛能和相關(guān)基因表達以及表面抗原標記的檢測對其進行鑒定。(2)利用MTT法檢測尼古丁對hUC-MSC增殖能力的影響,通過濃度梯度篩選出0.1mg/ml、0.2mg/ml和0.3mg/ml作為后續(xù)實驗的使用濃度;Transwell實驗來檢測不同濃度的尼古丁對hUC-MSC遷移能力的影響;流式細胞分析儀檢測尼古丁對hUC-MSC周期和凋亡的影響;Western blot和免疫熒光檢測不同濃度的尼古丁對hUC-MSC相關(guān)蛋白的表達。(3)用0.3mg/ml的尼古丁預處理hUC-MSC 24 h后與肺癌細胞株A549共培養(yǎng)24 h。(4)通過Transwell實驗和劃痕實驗來檢測共培養(yǎng)后的肺癌細胞株A549的遷移能力。(5)用共培養(yǎng)后的肺癌細胞株A549進行裸鼠皮下成瘤實驗來評價共培養(yǎng)后的細胞的致瘤能力。(6)對瘤體進行HE染色和免疫組化分析。結(jié)果:(1)從臍帶組織塊中成功分離出一類呈漩渦樣生長的長梭形細胞;經(jīng)過傳代純化后,能夠誘導成為成骨和脂肪細胞,并分別表達相應的基因;流式細胞鑒定符合hUC-MSC表面標記。(2)MTT結(jié)果表明尼古丁能夠抑制hUC-MSC的增殖,并呈濃度和時間依賴性,當尼古丁的濃度在0.1mg/ml到0.3mg/ml之間,不會抑制hUC-MSC的增殖;隨著尼古丁濃度的不斷增大,hUC-MSC的遷移能力在增強;流式細胞分析顯示經(jīng)過不同濃度的尼古丁處理后的hUC-MSC重阻滯在S期,細胞凋亡數(shù)量也隨之增加;Western blot和免疫熒光結(jié)果顯示E-cadherin蛋白表達降低,N-cadherin、Vimentin、β-catenin等EMT相關(guān)蛋白表達均升高,Sox2、Nanog、Sall4、Oct4等干性相關(guān)蛋白表達也都有不同程度的升高,Cyclin D1、Cyclin D3等周期相關(guān)蛋白表達也均有升高。(3)Transwell實驗和劃痕實驗顯示在共培養(yǎng)的條件下,實驗組的肺癌細胞株A549遷移能力比對照組的要強;裸鼠成瘤實驗顯示實驗組細胞成瘤的速度、腫瘤的大小、體積和質(zhì)量均高于對照組;HE和免疫組化染色顯示實驗組比對照組的細胞排列更加紊亂、高度異型性、核漿比升高、出現(xiàn)病理性核分裂象以及PCNA表達增強。結(jié)論:(1)在體外培養(yǎng)條件下,尼古丁能夠增強hUC-MSC的遷移能力和干性。(2)經(jīng)尼古丁預處理的hUC-MSC與肺癌細胞株A549共培養(yǎng)后,使得A549有更強的遷移能力、惡性程度以及體內(nèi)致瘤能力。
【關(guān)鍵詞】：尼古丁 間質(zhì)干細胞 A549 共培養(yǎng)
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-14
• 英文縮略詞中英文注釋表14-15
• 第一章 緒論15-23
• 1.1. 概述15-16
• 1.2. 臍帶間質(zhì)干細胞16-21
• 1.2.1. 干細胞16
• 1.2.2. 間質(zhì)干細胞16-17
• 1.2.3. 臍帶間質(zhì)干細胞17-18
• 1.2.4. 間質(zhì)干細胞的分離及鑒定18-19
• 1.2.5. 間質(zhì)干細胞的臨床應用19-20
• 1.2.6. 間質(zhì)干細胞與腫瘤20-21
• 1.2.7. 間質(zhì)干細胞與毒理學研究21
• 1.3. 尼古丁21-23
• 1.3.1. 尼古丁概述21-22
• 1.3.2. 尼古丁和間質(zhì)干細胞22
• 1.3.3. 尼古丁與腫瘤的研究22-23
• 第二章 研究目的、方法、方案及意義23-26
• 2.1. 研究目的23
• 2.2. 研究方法23-24
• 2.3. 實驗設計方案24-25
• 2.3.1. 間質(zhì)干細胞的分離和鑒定24
• 2.3.2. 尼古丁對間質(zhì)干細胞生物學特性的影響24-25
• 2.3.3. 尼古丁處理后的間質(zhì)干細胞對A549生物特性的影響25
• 2.4. 研究意義25-26
• 第三章 間質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)和鑒定26-39
• 3.1. 試劑材料與儀器26-27
• 3.1.1. 標本來源26
• 3.1.2. 實驗試劑和耗材26-27
• 3.1.3. 實驗儀器27
• 3.2. 相關(guān)溶液的配制27-28
• 3.2.1. L-DMEM培養(yǎng)液（1000 ml）27-28
• 3.2.2. 雙抗的配制28
• 3.2.3. 0.25%胰酶的配制（1000 ml）28
• 3.2.4. PBS的配制（1000 ml）28
• 3.2.5. 凍存液的配制(10 ml)28
• 3.3. 實驗方法28-33
• 3.3.1. 細胞的原代分離培養(yǎng)28-29
• 3.3.2. 細胞的傳代培養(yǎng)29
• 3.3.3. 細胞的凍存與復蘇29-30
• 3.3.4. 細胞表面標記鑒定30
• 3.3.5. 細胞多向分化潛能鑒定30-33
• 3.4. 實驗結(jié)果33-36
• 3.4.1. 細胞分離培養(yǎng)和鑒定33-34
• 3.4.2. 細胞多向分化潛能鑒定34-35
• 3.4.3. 細胞表面標記鑒定35-36
• 3.5. 討論36-39
• 第四章 尼古丁對臍帶間質(zhì)干細胞生物學特性的影響39-52
• 4.1. 試劑材料與儀器39-40
• 4.1.1. 實驗試劑和耗材39
• 4.1.2. 實驗儀器39-40
• 4.2. 相關(guān)溶液的配制40-41
• 4.2.1. MTT的配制40
• 4.2.2. 不同濃度的尼古丁的配制40
• 4.2.3. Western-blot相關(guān)試劑的配制40-41
• 4.3. 實驗方法41-44
• 4.3.1. 尼古丁對間質(zhì)干細胞增殖的影響41
• 4.3.2. 尼古丁對間質(zhì)干細胞遷移能力的影響41
• 4.3.3. 尼古丁對間質(zhì)干細胞周期和凋亡的影響41-42
• 4.3.4. 細胞蛋白的提取42
• 4.3.5. Western-blot42-43
• 4.3.6. 免疫熒光43
• 4.3.7. 統(tǒng)計分析43-44
• 4.4. 實驗結(jié)果44-50
• 4.4.1. 尼古丁對間質(zhì)干細胞增殖和形態(tài)的影響44-45
• 4.4.2. 尼古丁對間質(zhì)干細胞遷移能力的影響45-46
• 4.4.3. 尼古丁對間質(zhì)干細胞周期的影響46-47
• 4.4.4. 尼古丁對間質(zhì)干細胞凋亡的影響47-48
• 4.4.5. 尼古丁對間質(zhì)干細胞相關(guān)蛋白表達的影響48-50
• 4.5. 討論50-52
• 第五章 尼古丁處理后的臍帶間質(zhì)干細胞對肺癌細胞株A549生物特性的影響52-63
• 5.1. 試劑材料與儀器52-53
• 5.1.1. 肺癌細胞株和實驗裸鼠52
• 5.1.2. 實驗試劑和耗材52
• 5.1.3. 實驗儀器52-53
• 5.2. 相關(guān)溶液的配制53
• 5.2.1. 抗原修復液的配制53
• 5.2.2. 免疫組化專用PBS的配制53
• 5.3. 實驗方法53-56
• 5.3.1. 間質(zhì)干細胞與A549共培養(yǎng)體系的建立53-54
• 5.3.2. Transwell遷移實驗54
• 5.3.3. 劃痕實驗54
• 5.3.4. 平板克隆實驗54-55
• 5.3.5. 裸鼠皮下致瘤55
• 5.3.6. 組織切片HE染色55
• 5.3.7. 免疫組化55-56
• 5.3.8. 統(tǒng)計分析56
• 5.4. 實驗結(jié)果56-61
• 5.4.1. 共培養(yǎng)下對A549遷移能力的影響56-58
• 5.4.2. 共培養(yǎng)下對A549克隆形成能力的影響58-59
• 5.4.3. 共培養(yǎng)促進A549體內(nèi)生長59-60
• 5.4.4. 腫瘤組織病理切片分析60-61
• 5.5. 討論61-63
• 第六章 主要結(jié)論與展望63-64
• 6.1. 主要結(jié)論63
• 6.2. 展望63-64
• 參考文獻64-74
• 致謝74-75
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表的學術(shù)論文、獲獎及參加會議75
• 一、發(fā)表論文情況75
• 二、獲獎情況75
• 三、參加會議情況75

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