發(fā)布時間：2017-10-13 11:22

  本文關(guān)鍵詞：KIAA2018在骨肉瘤中的作用及其調(diào)控miRNAs的鑒定

  更多相關(guān)文章： 骨肉瘤 KIAA2018 Runx2 miRNA SNP

【摘要】：骨肉瘤是一種以骨質(zhì)破壞為特征的惡性腫瘤,是干細胞向成骨細胞分化過程中受遺傳或表觀遺傳變化影響的一種分化缺陷疾病。Runx2是骨肉瘤原癌基因,在骨肉瘤細胞中Runx2介導(dǎo)的成骨分化是紊亂的。KIAA2018隸屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族,目前尚無文獻報道該基因的功能。在人bHLH家族中,KIAA2018與C亞類中的AP-1親緣關(guān)系最近,同屬于E-Box調(diào)節(jié)因子。AP-1能通過Runx2 P1基礎(chǔ)核心啟動子上DNase敏感區(qū)域中的HLH/E-box(一種蛋白/DNA互作結(jié)構(gòu)域),靶向調(diào)控骨肉瘤原癌基因Runx2的轉(zhuǎn)錄,此外,骨肉瘤中血管生成、骨肉瘤細胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程所需的關(guān)鍵因子也都是其直接調(diào)控的下游基因。miRNA可通過堿基互補配對原則識別靶基因3’UTR上結(jié)合位點,在轉(zhuǎn)錄后水平以mRNA降解或抑制蛋白翻譯的方式負調(diào)控靶基因,進而參與疾病發(fā)生等多種生理過程。哺乳動物中,大約90%的基因可受miRNA的調(diào)控。本研究的目的是：1)在人骨肉瘤Saos-2細胞中抑制KAA2018表達,研究其對骨肉瘤原癌基因Runx2轉(zhuǎn)錄的影響；2)鑒定調(diào)控KIAA2018的miRNAs;3)篩選KIAA20183'UTR區(qū)的miRNA相關(guān)SNP。方法1.通過shRNA慢病毒介導(dǎo)構(gòu)建KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型,qPCR檢測對照組Saos-2細胞和KIAA2018敲降型Saos-2細胞中Runx2在mRNA水平上的差異。2.運用Diana-micro、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、 Targetscan、miRWalk9種miRNA靶基因分析工具,預(yù)測可能調(diào)控人KIAA2018的miRNA,后運用熒光素酶報告基因法進行實驗驗證；之后,再進一步合成相應(yīng)miRNA的模擬物和抑制劑轉(zhuǎn)染293T細胞,利用qPCR檢測內(nèi)源性miR-27a的表達變化對KIAA2018的影響。3.首先運用miRNASNPv2.0、mrSNP和SNPinfo篩選KIAA20183'UTR區(qū)的miRNA相關(guān)SNP,然后對候選SNP分別構(gòu)建插入野生型KIAA20183'UTR和突變型KIAA20183'UTR的psi-CHECK2重組表達載體以及插入相應(yīng)pre-miRNA的pCMV-MIR重組載體,最后運用雙熒光素酶報告基因法進行檢測。結(jié)果1.利用PHBLV-U6-GFP-T2A-Puro慢病毒載體系統(tǒng),成功構(gòu)建了KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型,qPCR結(jié)果顯示與正常Saos-2細胞相比,KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞中RUNX2的mRNA水平降低至約34%。2.運用Diana-micro、miRanda、miRDB、PICTAR、PITA、RNA22、RNAhybrid、 Targetscan和miRWalk分析KIAA2018基因,Diana-microT、miRanda、miRDB和TargetSacan顯示KIAA2018可能受miR-27a、miR-96、miR-199a和miR-216a調(diào)控；而分析這4個miRNA可能的靶基因時,只有miR-27a的靶基因中含有KIAA2018。 TargetScan分析結(jié)果揭示miR-27a成熟序列中與KIAA2018作用的8個堿基在脊椎動物中高度保守。雙熒光素酶報告基因檢測證實miR-27a調(diào)控KIAA2018的表達。進一步檢測miR-27a對內(nèi)源性KIAA2018轉(zhuǎn)錄的影響,qPCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-27a mimics提高內(nèi)源性miR-27a表達,引起KIAA2018 mRNA水平下調(diào)40.4%(p0.01)；而轉(zhuǎn)染miR-27a inhibitor抑制內(nèi)源性miR-27a表達,引起KIAA2018 mRNA水平上調(diào)39.8%(p0.01)。3. KIAA2018 3'UTR區(qū)上的兩個SNP rs9814605 (chr3:113372048, T/C)和SNPrs13065268 (chr3:113372047, G/A)能影響miR-513a-5p與KIAA2018的結(jié)合。當(dāng)SNPrs9814605位點由T→C時,miR-513a-5p不能與KIAA2018結(jié)合(p0.01)；當(dāng)SNPrs13065268位點由G→A時,miR-513a-5p不能與KIAA2018結(jié)合(p0.01)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果與預(yù)測一致,且發(fā)現(xiàn)當(dāng)rs9814605為T等位基因,同時rs13065268為G等位基因時,它們共同引起的miR-513a-5p對KIAA2018的下調(diào)作用顯著增強。結(jié)論1. KIAA2018可通過調(diào)控骨肉瘤原癌基因Runx2在骨肉瘤中發(fā)揮作用。2. miR-27a可能調(diào)控KIAA2018的表達與骨肉瘤相關(guān)聯(lián)。3. KIAA2018 3'UTR的SNP rs9814605和SNPrs13065268能影響與骨肉瘤有關(guān)的miR-513a-5p與KIAA2018的結(jié)合。
【關(guān)鍵詞】：骨肉瘤 KIAA2018 Runx2 miRNA SNP
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R738.1
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-12
• 第一章 前言12-22
• 1.1 骨肉瘤相關(guān)基因研究進展12-16
• 1.1.1 抑癌基因12-13
• 1.1.2 原癌基因13-14
• 1.1.3 新型研究熱點-Runx2基因14-16
• 1.2 KIAA2018基因16-18
• 1.2.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子超家族成員——KIAA201816
• 1.2.2 KIAA2018的親緣性蛋白——AP-116-18
• 1.3 miRNA18-20
• 1.3.1 miRNA的生成和作用機制18-19
• 1.3.2 miRNA相關(guān)SNP19
• 1.3.3 miRNA與骨肉瘤19-20
• 1.4 本研究的目的與意義20-22
• 第二章 材料與方法22-37
• 2.1 材料22-26
• 2.1.1 主要材料22-24
• 2.1.2 主要試劑24-25
• 2.1.3 主要儀器25-26
• 2.2 方法26-37
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)26
• 2.2.2 感受態(tài)細胞DH5α的制備26
• 2.2.3 生物信息學(xué)工具26-27
• 2.2.4 野生型重組載體構(gòu)建27-30
• 2.2.5 突變型載體構(gòu)建30-31
• 2.2.6 KIAA2018敲降型Saos-2細胞模型的構(gòu)建31-32
• 2.2.7 細胞轉(zhuǎn)染32-33
• 2.2.8 RT-qPCR33-35
• 2.2.9 雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測35-36
• 2.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析36-37
• 第三章 結(jié)果37-50
• 3.1 慢病毒介導(dǎo)shRNA沉默人KIAA2018對Runx2表達的影響37-42
• 3.1.1 人KIAA2018慢病毒干擾載體的構(gòu)建37-39
• 3.1.2 人KIAA2018慢病毒干擾載體的包裝39
• 3.1.3 慢病毒滴度測定39-41
• 3.1.4 KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型的構(gòu)建41
• 3.1.5 KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型的鑒定41-42
• 3.1.6 KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞中Runx2的轉(zhuǎn)錄水平42
• 3.2 調(diào)控KIAA2018的miRNA的鑒定42-46
• 3.2.1 生物信息學(xué)分析42-43
• 3.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測43-45
• 3.2.3 過表達外源性miR-27a對KIAA2018轉(zhuǎn)錄水平的影響45-46
• 3.2.4 抑制內(nèi)源性miR-27A對KIAA2018轉(zhuǎn)錄水平的影響46
• 3.3 KIAA2018 3'UTR區(qū)miRNA相關(guān)SNP的鑒定46-50
• 3.3.1 生物信息學(xué)分析46-47
• 3.3.2 熒光素酶報告基因法檢驗47-50
• 第四章 討論50-53
• 4.1 KIAA2018基因敲降型Saos-2細胞模型的構(gòu)建50
• 4.2 人骨肉瘤細胞中KIAA2018沉默對Runx2轉(zhuǎn)錄的影響50-51
• 4.3 miR-27a/KIAA2018/骨肉瘤51-52
• 4.4 KIAA2018 3'UTR區(qū)miRNA相關(guān)SNP rs9814605和rs1306526852-53
• 參考文獻53-64
• 碩士期間已發(fā)表學(xué)術(shù)成果64-65
• 致謝65

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李健,郭衛(wèi),楊榮利,曲華毅,樊瑞峰;影響骨肉瘤預(yù)后因素的探討[J];中國骨腫瘤骨病;2004年06期

2 鮑同柱,趙紅衛(wèi),鄭啟新,劉萬軍,劉勇;反義轉(zhuǎn)化生長因子-β1基因?qū)侨饬黾毎磉_轉(zhuǎn)移相關(guān)因子的影響[J];中華實驗外科雜志;2005年04期

3 牛聚偉;吳剛;祝少博;漆白文;錢煒;喻愛喜;;血管擴張刺激磷蛋白與骨肉瘤細胞遷移能力的關(guān)系[J];武漢大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年06期

4 孟令祥,于錫欣,杜德利,王冠忠;P~(16)基因在骨肉瘤中的表達[J];山東醫(yī)藥;1999年06期

5 林娜,蔡宣松,梅炯;骨肉瘤預(yù)后因素探討[J];實用腫瘤雜志;2000年05期

6 姜文學(xué),董天華,吳士良,馬文雄;骨肉瘤特異性細胞毒T淋巴細胞的誘導(dǎo)及其抗腫瘤特性的研究[J];中華骨科雜志;2000年01期

7 馬忠泰,栗懷廣,施學(xué)東;骨肉瘤的化療與療效判斷[J];中華骨科雜志;2000年S1期

8 岳文,楊連甲,馬明,董紹忠;體內(nèi)和體外實驗觀察骨形成蛋白在骨肉瘤中的作用[J];口腔頜面外科雜志;2000年03期

9 姜文學(xué),董天華,吳士良,馬文雄;體外誘導(dǎo)骨肉瘤特異性細胞毒T淋巴細胞的實驗研究[J];中國矯形外科雜志;2000年03期

10 郭喬楠,陳意生;骨肉瘤細胞增殖活性的測定及其與預(yù)后的關(guān)系[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2000年12期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李紅;龍勉;;力學(xué)微擾對骨肉瘤細胞生物學(xué)行為的影響[A];第十次中國生物物理學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

2 金先慶;羅小輯;;骨肉瘤細胞骨分化標志檢測及臨床意義[A];中國抗癌協(xié)會第七屆全國小兒腫瘤學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

3 李進;楊述華;鄒利軍;邵增務(wù);廖翔;;單啟動子雙表達載體pIRES-p14ARF-p53的構(gòu)建及其對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用[A];泛長江流域骨科新進展暨第九屆全國骨科護理研討會論文匯編[C];2007年

4 李進;楊述華;鄒利軍;邵增務(wù);廖翔;;單啟動子雙表達載體pIRES-p14ARF-p53的構(gòu)建及其對骨肉瘤細胞增殖的抑制作用[A];第八屆全國脊柱脊髓損傷學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2007年

5 胡宏偉;孫其志;;骨肉瘤的治療進展[A];第十七屆中國康協(xié)肢殘康復(fù)學(xué)術(shù)年會暨第三屆海峽兩岸OS會議論文匯編[C];2008年

6 于秀淳;王偉;;影響骨肉瘤新輔助化療療效的多因素分析[A];第四屆中國腫瘤學(xué)術(shù)大會暨第五屆海峽兩岸腫瘤學(xué)術(shù)會議教育集[C];2006年

7 張瑤;;四肢長骨骨肉瘤合并病理性骨折圍手術(shù)期的護理[A];全國腫瘤護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2006年

8 張瑤;;四肢長骨骨肉瘤合并病理性骨折圍手術(shù)期的護理[A];全國第八屆骨科護理學(xué)術(shù)交流暨專題講座會議論文匯編[C];2006年

9 張志明;;外傷誘發(fā)骨肉瘤一例分析[A];第四次全國法醫(yī)學(xué)術(shù)交流會論文集（上卷）[C];1991年

10 楊迪生;解先寬;葉招明;陶惠民;;反義C-myc重組腺病毒的構(gòu)建及其抗骨肉瘤細胞作用的實驗研究[A];2004年浙江省骨科學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 任勇 李運紅 胡顏;莫名關(guān)節(jié)痛青少年警惕骨肉瘤[N];天津日報;2006年

2 黃金昶;骨肉瘤可試用斑蝥治療[N];健康報;2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉巍;UHRF1在骨肉瘤細胞侵襲過程中的作用及其機制研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

2 陳杰;HDAC5在骨肉瘤細胞增殖中的表觀遺傳學(xué)調(diào)控研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

3 馬萬里;miR-148a在骨肉瘤患者體內(nèi)的表達及其功能機制的研究[D];山東大學(xué);2015年

4 田吉光;CD271~+骨肉瘤干細胞特性研究及以DNA-PK為靶點逆轉(zhuǎn)骨肉瘤化療耐藥性的研究[D];山東大學(xué);2015年

5 張巖;低分化骨肉瘤細胞株惡性逆轉(zhuǎn)機制的研究[D];華中科技大學(xué);2006年

6 廖博;骨肉瘤相關(guān)抗原的免疫學(xué)篩選及其生物信息學(xué)分析[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

7 郝新保;骨肉瘤細胞與巨噬細胞融合誘導(dǎo)主動性抗腫瘤免疫效應(yīng)的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 劉先哲;靶向沉默蛋白激酶Polo-like Kinase 1治療骨肉瘤的實驗研究[D];華中科技大學(xué);2012年

9 司萌;骨肉瘤干細胞及其多藥耐藥性的體內(nèi)外相關(guān)研究[D];山東大學(xué);2013年

10 李金平;長鏈非編碼RNA在骨肉瘤患者中的差異表達研究[D];中南大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王井偉;SiRNA沉默XIAP基因?qū)侨饬鯩G-63細胞生物學(xué)特性的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李宏維;反義RNA抑制c-myc表達增強骨肉瘤細胞對順鉑的敏感性[D];蘭州大學(xué);2015年

3 陳孜;HER-2在骨肉瘤中的表達及篩選其適配子方法的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

4 胡新宇;PI3K/Akt在Wnt5a誘導(dǎo)的人骨肉瘤細胞遷移中作用機制的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

5 王春燕;SKA1對骨肉瘤惡性增殖的影響及骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者預(yù)后相關(guān)因素的研究[D];蘇州大學(xué);2015年

6 王小強;MG63骨肉瘤細胞中的iNOS的信號調(diào)控機制[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 趙迎杰;順鉑聯(lián)合環(huán)靶明對骨肉瘤MG-63細胞增殖和凋亡的影響[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

8 唐宏亮;Nestin在骨肉瘤中的表達及意義[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

9 毛德舉;骨肉瘤干細胞的分選及惡性表型的鑒定[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 陳婕;KIAA2018在骨肉瘤中的作用及其調(diào)控miRNAs的鑒定[D];華中師范大學(xué);2015年

，

本文編號：1024571