本文關(guān)鍵詞：剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞膜表面張力變化的可視化研究

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【摘要】：目標(biāo)：血流剪切應(yīng)力對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向作用可能是引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要原因之一。剪切應(yīng)力作用于細(xì)胞膜上表面,首先引起細(xì)胞膜表面張力的改變,這種物理改變可能是腫瘤細(xì)胞定向遷移的基礎(chǔ),但目前尚未有針對(duì)剪切應(yīng)力作用下腫瘤細(xì)胞膜表面張力的分布模式的研究。本文將采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)技術(shù)對(duì)剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞膜表面張力變化模式及其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探究。方法：本文首先采用常規(guī)亞克隆技術(shù),利用具備分子彈簧功能的蜘蛛絲蛋白序列(GPGGA)8及一對(duì)可以發(fā)生FRET的熒光蛋白ECFP/YPet設(shè)計(jì)制備可以可視化檢測(cè)細(xì)胞膜表面張力變化的FRET探針,并通過人為改變細(xì)胞膜表面張力對(duì)該探針進(jìn)行了驗(yàn)證。其次采用平行平板流動(dòng)腔對(duì)HeLa細(xì)胞施加不同大小的定常層流剪切應(yīng)力,并且利用多種試劑作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架,在FRET熒光顯微鏡下動(dòng)態(tài)記錄單個(gè)細(xì)胞的表面熒光FRET變化。然后通過Meta Fluor軟件處理熒光照片,得到細(xì)胞FRET ratio圖像的整體趨勢(shì),而后采用MATLAB軟件編程,把細(xì)胞圖像沿著力的方向分成50等份,得到細(xì)胞膜上表面張力的局部變化數(shù)據(jù),并采用Hill方程擬合沿流體方向的FRET數(shù)據(jù),探究剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表而張力的局部分布變化規(guī)律。結(jié)果：探針的FRET ratio變化可以反映細(xì)胞膜表面張力的動(dòng)態(tài)變化；在層流剪切應(yīng)力的作用下,細(xì)胞膜表面張力沿流體方向呈現(xiàn)中游高、上下游低的分布模式,細(xì)胞膜表面張力整體水平增高,其幅度與剪切應(yīng)力大小呈現(xiàn)正相關(guān),且最高點(diǎn)所在位置隨力的增大向細(xì)胞上游偏移,上游增高幅度大于下游；加載剪切應(yīng)力之前人為改變細(xì)胞膜流動(dòng)性,苯甲醇處理會(huì)使得細(xì)胞膜表面張力升高更顯著,而膽固醇作用后細(xì)胞膜表面張力整體下降明顯,但仍然呈現(xiàn)與對(duì)照組類似的上下游非均勻性分布變化。采用Nocodazole、 Cytochalasin-D及ML7分別破壞細(xì)胞骨架微管、微絲或抑制微絲收縮,細(xì)胞膜表面張力在剪切應(yīng)力作用下仍呈現(xiàn)中間高而上下游偏低的模式；破壞微管使剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的整體增高受到明顯抑制,并且局部分布發(fā)生了明顯變化,最高值幅度有所下降而且向上游側(cè)偏移,而且上下游的變化幅度趨于一致；微絲解聚后對(duì)整體表面張力的增高沒有顯著影響,但卻導(dǎo)致上下游表面張力增高幅度的反轉(zhuǎn);而抑制微絲收縮也在一定程度上抑制了剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的增高,而且對(duì)上下游非均勻性分布變化也有顯著影響。結(jié)論：本文成功構(gòu)建了可用于可視化檢測(cè)細(xì)胞膜表面張力變化的FRET生物探針,為細(xì)胞膜生物物理相關(guān)研究提供了一種有力的工具。剪切應(yīng)力作用下,腫瘤HeLa細(xì)胞膜表面張力變化出現(xiàn)了上下游非均勻的分布,可能是流體作用下腫瘤細(xì)胞定向遷移的基礎(chǔ)。細(xì)胞膜流動(dòng)性的改變對(duì)細(xì)胞膜表面張力大小存在顯著影響,但并不能顯著改變剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力非均勻分布的規(guī)律。細(xì)胞骨架的完整性對(duì)剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的非均勻分布起著決定性作用,其中微管系統(tǒng)起著主導(dǎo)作用,而微絲系統(tǒng)相對(duì)影響較弱。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞膜表面張力 剪切應(yīng)力 細(xì)胞膜流動(dòng)性 細(xì)胞骨架
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R730.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-18
• 1.1 機(jī)械應(yīng)力在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑10
• 1.2 力在細(xì)胞內(nèi)的物理傳導(dǎo)機(jī)制10-14
• 1.2.1 力在細(xì)胞內(nèi)的傳遞途徑11-13
• 1.2.2 剪切應(yīng)力和牽張力的應(yīng)力物理傳遞異同13-14
• 1.3 研究細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力物理傳導(dǎo)的方法14-17
• 1.3.1 早期的研究方法14-15
• 1.3.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)15-17
• 1.4 本文的研究目的17-18
• 2 膜表面張力FRET熒光探針的設(shè)計(jì)與制備18-33
• 2.1 FRET探針設(shè)計(jì)18-20
• 2.1.1 原理18-19
• 2.1.2 MSS設(shè)計(jì)以及KMSS對(duì)照設(shè)計(jì)19-20
• 2.2 材料20-23
• 2.2.1 引物20-21
• 2.2.2 試劑21
• 2.2.3 儀器21-22
• 2.2.4 溶液22-23
• 2.3 方法23-28
• 2.3.1 PCR擴(kuò)增24
• 2.3.2 核酸純化24-25
• 2.3.2.1 瓊脂糖凝膠電泳24-25
• 2.3.2.2 凝膠回收提純25
• 2.3.3 限制性酶切25
• 2.3.4 連接25-26
• 2.3.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)26
• 2.3.6 質(zhì)粒提取26-27
• 2.3.7 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染27
• 2.3.8 FRET顯微拍照與圖像分析27-28
• 2.4 結(jié)果28-31
• 2.4.1 測(cè)序結(jié)果28-29
• 2.4.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光驗(yàn)證29-30
• 2.4.3 質(zhì)粒功能驗(yàn)證30-31
• 2.5 討論31-33
• 3 剪切應(yīng)力作用下的細(xì)胞膜表面的張力變化33-51
• 3.1 材料和方法33-39
• 3.1.1 試劑33
• 3.1.2 儀器33-34
• 3.1.3 細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)的構(gòu)建34-36
• 3.1.3.1 剪切應(yīng)力加載裝置34-35
• 3.1.3.2 細(xì)胞應(yīng)力加載35-36
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)36-37
• 3.1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組36
• 3.1.4.2 實(shí)驗(yàn)試劑配制36-37
• 3.1.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟37
• 3.1.5 圖像分析37-38
• 3.1.6 數(shù)據(jù)處理與分析38-39
• 3.2 結(jié)果39-48
• 3.2.1 不同大小的剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的變化39-42
• 3.2.2 細(xì)胞膜流動(dòng)性對(duì)剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力分布的影響42-45
• 3.2.3 細(xì)胞骨架對(duì)剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力分布的影響45-48
• 3.3 討論48-51
• 4 結(jié)論51-52
• 參考文獻(xiàn)52-58
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況58-59
• 致謝59-60

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 劉波;覃開蓉;;FRET技術(shù)在應(yīng)力信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中的應(yīng)用[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2013年06期

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本文編號(hào)：1024325