本文關鍵詞：康萊特注射液聯(lián)合吉非替尼對人肺腺癌NCI-H1975細胞株的作用研究

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【摘要】：目的:如今肺癌的發(fā)病率已位于我國惡性腫瘤首位。由于肺癌的早期癥狀較為隱匿,確診時大多數(shù)病人已屬于晚期�；熓欠伟┲委煹幕�,但化療的不良反應較大,且療效已達到平臺期,隨著分子靶向治療的出現(xiàn),晚期非小細胞肺癌的治療也由傳統(tǒng)的化療轉向以基因分型為指導的分子靶向治療。其中應用較多的是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)類藥物,如吉非替尼、厄洛替尼、�？颂婺岬�。但隨著EGFR-TKI類藥物的廣泛應用耐藥問題也相應產生,其中T790M突變約占EGFR-TKI耐藥的50%~60%。而我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗腫瘤治療中有其特殊功效,因此人們開始探索將傳統(tǒng)中藥與EGFR-TKI類藥物聯(lián)合應用能否解決EGFR-TKI類藥物耐藥問題�？等R特注射液是一種以薏苡仁為主要成份的中藥,它對多種腫瘤細胞具有抗腫瘤作用,尤其對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞有較強的抑制和殺傷作用。目前研究證明PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路在NSCLC的凋亡、增殖、侵潤等一系列生物學過程中具有重要作用。本研究擬通過將吉非替尼、康萊特注射液以及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液不同干預處理,作用于T790M基因突變的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐藥細胞株,并檢測各處理組的細胞生長抑制情況,各處理組在PI3K/Akt及MAPK/ERK信號通路中Akt和MAPK1(ERK2)基因的表達情況以及相應p-Akt和p-ERK蛋白表達情況,來對康萊特注射液聯(lián)合吉非替尼對存在T790M突變的人肺腺癌NCI-H1975吉非替尼耐藥細胞株的作用及其機制進行探索研究。方法:1體外培養(yǎng)人肺腺癌NCI-H1975細胞,選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。實驗分為空白對照組,吉非替尼組,康萊特注射液組,吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組;吉非替尼組設置濃度分別為:0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L,作用時間分別為:24h、48h、72h;康萊特注射液組設置濃度分別為:5μl/ml、10μl/ml、20μl/ml、40μl/ml、80μl/ml、100μl/ml、160μl/ml,作用時間分別為:24h、48h、72h;應用四甲基偶氮唑藍(tetrzolium-based colorimetric assay,MTT)法分別測定吉非替尼組和康萊特注射液組的不同濃度、不同作用時間的抑制率繪制生長曲線,并分別計算吉非替尼組30%抑制率所對應濃度(IC30)與康萊特注射液組50%抑制率所對應濃度(IC50)。2確定聯(lián)合用藥組濃度及作用時間:根據(jù)MTT結果,吉非替尼組IC30=25μl/ml,康萊特注射液組IC50=40μl/ml,故聯(lián)合用藥組吉非替尼取25μl/ml,康萊特注射液取40μl/ml,作用時間為48小時,應用MTT法檢測定各時間聯(lián)合用藥組的抑制率。3取對數(shù)生長期細胞,按上述分組進行處理。藥物作用48h后提取總RNA,檢測總RNA的量、純度及濃度,通過逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription PCR,RT-PCR)半定量檢測各組細胞內Akt基因和MAPK1(ERK2)基因的m RNA的表達水平。4選取對數(shù)生長期細胞置入六孔板培養(yǎng),分組處理同上。藥物作用48h后提取總蛋白,檢測總蛋白濃度,蛋白質印跡(Western-blot)法檢測各組p-Akt與p-ERK蛋白表達情況。5運用IBM SPSS Statistics 22.0.0.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理。結果:1 MTT結果顯示:1.1與對照組相比,隨著康萊特注射液組濃度增加及作用時間的延長,對人肺腺癌NCI-H1975細胞的抑制率逐漸升高,其抑制作用有劑量及時間依賴效應;吉非替尼單藥24h組隨藥物濃度的升高,在0.1-5μmol/l范圍內未見其對人肺腺癌NCI-H1975細胞有明顯抑制情況,在10-50μmol/l范圍內出現(xiàn)對人肺腺癌NCI-H1975細胞生長輕度抑制,在吉非替尼單藥48h、72h組對人肺腺癌NCI-H1975細胞的抑制率逐漸升高,呈時間、劑量依賴關系。1.2聯(lián)合用藥組:吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液培養(yǎng)48h后,兩藥聯(lián)合作用抑制率高于各單藥組,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2 RT-PCR結果顯示:吉非替尼組、康萊特注射液組以及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組與對照組相比,Akt和MAPK1(ERK2)基因的m RNA的表達水平均有所下調,其中以聯(lián)合組下調最為明顯,有統(tǒng)計學意義(P0.05);3 Western-blot結果顯示:吉非替尼組、康萊特注射液組以及吉非替尼聯(lián)合康萊特注射液組與對照組相比,p-AKT蛋白和p-ERK蛋白的表達水平均有所下調,其中以聯(lián)合組下調最為明顯,有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1康萊特注射液和吉非替尼單獨應用對人肺腺癌NCI-H1975細胞生長均有抑制作用,而兩藥聯(lián)合抑制作用增強,具有協(xié)同增效作用。2康萊特注射液和吉非替尼單獨應用均能下調Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表達水平,而兩藥聯(lián)合對Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表達水平下調作用更顯著。3康萊特注射液具有一定逆轉人肺腺癌NCI-H1975細胞耐吉非替尼的作用,可能與下調耐藥細胞內Akt和MAPK1(ERK2)基因以及p-Akt和p-ERK蛋白表達水平相關。
【關鍵詞】：吉非替尼 康萊特注射液 耐藥 癌 非小細胞肺 Akt ERK
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-22
• 結果22-24
• 附圖24-27
• 附表27-31
• 討論31-35
• 結論35-36
• 參考文獻36-40
• 綜述 晚期非小細胞肺癌EGFR-TKIs耐藥機制及其研究進展40-52
• 參考文獻46-52
• 致謝52-53
• 個人簡歷53

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本文編號：1023519