本文關(guān)鍵詞：hMOB2對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲以及與ECM黏附影響的研究

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【摘要】：目的：人單極紡錘體1結(jié)合蛋白2(human monopolar spindle-one-binder 2, hMOB2)是hMOB蛋白家族成員之一,研究顯示,hMOB2可以調(diào)控細(xì)胞中細(xì)胞核-Dbf2相關(guān)激酶(NDR)的活性,影響中心體復(fù)制、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等過程,但是hMOB2的表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的黏附和遷移的關(guān)系尚未見報道。本研究的目的就是研究hMOB2是否影響肝癌細(xì)胞HepG2的遷移和侵襲以及與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的黏附,初步闡明hMOB2調(diào)控HepG2細(xì)胞遷移、侵襲的作用方式及機(jī)制。方-法：以HepG2細(xì)胞為研究對象,采用慢病毒介導(dǎo)的基因過表達(dá)和RNA干擾等手段,在細(xì)胞中過量表達(dá)hMOB2以及干擾細(xì)胞內(nèi)1iMOB2表達(dá),研究hMOB2對HepG2細(xì)胞與ECM黏附、遷移和侵襲的影響。(1)利用RT-qPCR和Western blot方法檢測過表達(dá)和干擾表達(dá)后的細(xì)胞中hMOB2的mRNA水平和蛋白水平,并檢測1iMOB2對FAK、Src和paxillin的表達(dá)以及活性的影響。(2)分別利用MTT和CCK-8方法檢測慢病毒介導(dǎo)的hMOB2基因過表達(dá)和RNA干擾表達(dá)等對HepG2細(xì)胞活力的影響。(3)分別利用franswell細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞侵襲實驗研究hMOB2對HepG2細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(4)利用腫瘤細(xì)胞與I型膠原的黏附實驗以及細(xì)胞鋪展實驗研究hMOB2對HepG2細(xì)胞與ECM黏附以及在基質(zhì)上鋪展的影響。(5)利用免疫熒光實驗觀察hMOB2對HepG2細(xì)胞中黏著斑復(fù)合體的形成和肌動蛋白纖維的分布、張力纖維裝配、絲狀和片狀偽足形成等的影響。結(jié)果：RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明,LV-hMOB2'慢病毒感染后的HepG2細(xì)胞中hMOB2過表達(dá),LV-sihMOB2-4感染HepG2細(xì)胞后可以有效地敲低hMOB2的表達(dá),因此LV-hMOB2和LV-sihMOB2-4(后續(xù)用LV-sihMOB2命名)慢病毒可用于后續(xù)細(xì)胞水平的實驗。(1) MTT實驗和CCK-8實驗結(jié)果顯示,與空白對照(Mock)、對照慢病毒(LV-CTL)和對照RNA干擾慢病毒(LV-siCTL)感染組相比,hMOB2過表達(dá)(LV-hMOB2組)和RNA干擾表達(dá)(LV-siMOB2組)對HepG2細(xì)胞的活力無明顯影響。(2) Transwell細(xì)胞遷移實驗和細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果顯示,hMOB2過表達(dá)極顯著抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲過程(p0.01),而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)也可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲(p0.05)。(3)腫瘤細(xì)胞與I型膠原黏附實驗結(jié)果顯示,hMOB2過表達(dá)可以顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞與基質(zhì)的黏附(正0.01),而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞與基質(zhì)的黏附(p0.05)；另外,細(xì)胞鋪展結(jié)果也顯示,hMOB2過表達(dá)可以影響HepG2細(xì)胞在Ⅰ型膠原上的鋪展。(4)免疫熒光染色細(xì)胞中paxillin,結(jié)果顯示,hMOB2過表達(dá)可以促進(jìn)黏著斑的形成,與空白對照(Mock)、對照慢病毒(LV-CTL)和對照RNA干擾慢病毒(LV-siCTL)感染組相比,過表達(dá)hMOB2的細(xì)胞中黏著斑的數(shù)量和大小都顯著增加,并分散分布于整個細(xì)胞；而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞中黏著斑的形成,并主要分布在細(xì)胞周圍。利用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞中的肌動蛋白纖維,結(jié)果顯示,過表達(dá)hMOB2的HepG2細(xì)胞中張力纖維粗大、數(shù)目增多,細(xì)胞邊緣的絲狀偽足和片狀偽足顯著減少,而RNA干擾敲低liMOB2表達(dá)則可以抑制HepG2細(xì)胞中張力纖維的形成, F-actin集中分布在細(xì)胞周圍或邊緣。(5) Western blot實驗結(jié)果顯示,過表達(dá)hMOB2可以上調(diào)HepG2細(xì)胞中pY397FAK、pY925FAK和pY118paxillin,下調(diào)pY527Src;而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)則可以下調(diào)HepG2細(xì)胞中pY397FAK. pY925FAK和pY118 paxillin,但對pY527Src無顯著影響。無論過表達(dá)還是干擾表達(dá)hMOB2對細(xì)胞中總的FAK、Src和paxillin的表達(dá)均無顯著影響。結(jié)論：本研究結(jié)果表明：(1)過表達(dá)hMOB2抑制細(xì)胞的遷移和侵襲很可能是由于hMOB2過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞與ECM的過度黏附所致,而RNA干擾敲低hMOB2表達(dá)抑制細(xì)胞遷移和侵襲有可能是下調(diào)hMOB2表達(dá)負(fù)調(diào)控細(xì)胞與ECM黏附的結(jié)果。(2) hMOB2過表達(dá)和干擾表達(dá)對HepG2細(xì)胞遷移、侵襲以及對細(xì)胞與ECM的黏附的影響可能是通過調(diào)控細(xì)胞中黏著斑復(fù)合體的裝配和肌動蛋白細(xì)胞骨架纖維的重塑來實現(xiàn)的。(3) hMOB2過表達(dá)和干擾表達(dá)影響HepG2細(xì)胞遷移、侵襲以及細(xì)胞與ECM的黏附可能需要通過激活FAK-Src-paxillin信號分子調(diào)控黏著斑復(fù)合體的裝配和肌動蛋白細(xì)胞骨架纖維的重塑來實現(xiàn)。
【關(guān)鍵詞】：HepG2細(xì)胞 hMOB2 細(xì)胞遷移 細(xì)胞侵襲 細(xì)胞黏附
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 中文摘要2-5
• Abstract5-9
• 符號說明9-11
• 1 實驗材料與方法11-19
• 2 實驗結(jié)果和分析19-32
• 3 討論32-35
• 4 結(jié)論35-36
• 5 參考文獻(xiàn)36-40
• 綜述40-53
• 參考文獻(xiàn)46-53
• 附錄53-54
• 致謝54-55
• 攻讀學(xué)位期間完成的論文55-56

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本文編號：1023136