本文關(guān)鍵詞：雙熒光素酶報告基因檢測miR-185與AKT1靶標(biāo)關(guān)系

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【摘要】：【目的】本課題小組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在A549,NCI-H1975,NCI-H1650和LTEP-a-2四種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中mi R-185表達(dá)明顯下調(diào),絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(Serine/threonine Protein Kinase 1,AKT1)表達(dá)明顯升高,二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,提示mi R-185對AKT1具有調(diào)控作用,AKT1可能是mi R-185的潛在靶基因,但不能確定二者直接相關(guān)。為了研究mi R-185與AKT1之間靶標(biāo)關(guān)系,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建克隆有目的基因片段的雙熒光素酶報告基因載體,利用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)驗(yàn)證二者相互關(guān)系。為后續(xù)進(jìn)一步探討mi R-185和AKT1基因在肺癌發(fā)生、發(fā)展過程中可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。【方法】利用生物信息學(xué)軟件,預(yù)測mi R-185調(diào)控AKT1基因結(jié)合序列,設(shè)計合成AKT13’-UTR序列及突變后AKT13’-UTR序列,將合成的兩種目的基因片段,分別克隆到pmir GLO雙熒光素酶報告基因載體,構(gòu)建AKT13’-UTR雙熒光素酶報告基因野生型載體(pmir GLO-AKT1)及其突變型載體(pmir GLO-mut-AKT1)。重組載體經(jīng)PCR電泳和基因測序鑒定,以證明重組載體構(gòu)建成功。使用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine TM 2000分別將這兩種重組載體質(zhì)粒與mi R-185模擬物(mimics)或mi R-185陰性對照(Negative Control,NC)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,并利用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測其活性。雙熒光素酶報告基因載體中含有能在同一細(xì)胞中同時表達(dá)的兩種熒光素酶基因,一個是螢火蟲熒光素酶報告基因,另一個是海腎熒光素酶報告基因。螢火蟲熒光素酶報告基因?yàn)橹饕獔蟾婊?目的基因片段被克隆至螢火蟲熒光素酶報告基因下游的多克隆位點(diǎn)上(Mμltiple cloning site,MCS)。若目的基因表達(dá)被抑制,則使螢火蟲熒光素酶轉(zhuǎn)錄過程受阻,抑制螢火蟲熒光素酶蛋白翻譯,螢火蟲熒光值下降,而作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參照的海腎熒光素酶的表達(dá)不受影響,此時螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性值下降,從而可以確定mi RNA與靶基因是否具有直接調(diào)控作用。【結(jié)果】PCR電泳及基因測序結(jié)果顯示,PCR擴(kuò)增得到的含有AKT1 3’-UTR和突變后AKT1 3’-UTR序列的目的片段大小及序列與Gene Bank報道序列一致,且插入方向正確。因此,成功構(gòu)建含有mi R-185結(jié)合位點(diǎn)的和其突變位點(diǎn)的兩種重組質(zhì)粒。雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染克隆有AKT1 3’-UTR突變型載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中,mi R-185組與陰性對照組比較,熒光素酶的活性值差異無顯著性(F=2.29,P0.05);轉(zhuǎn)染克隆有AKT1 3’-UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中,mi R-185組熒光素酶活性明顯受到抑制,與陰性對照組比較,熒光素酶的活性差異有顯著性(F=80.39,P0.05)。【結(jié)論】成功構(gòu)建AKT1基因3’-UTR雙熒光素酶報告基因載體及其突變型載體;AKT1基因是mi R-185直接作用的靶基因,且mi R-185結(jié)合于AKT1基因的3’-UTR區(qū)域,在轉(zhuǎn)錄后水平對AKT1基因有直接抑制作用。
【關(guān)鍵詞】：微小RNA-185 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1 pmirGLO載體 3’-端非編碼區(qū) 雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)
【學(xué)位授予單位】：蚌埠醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 材料與方法13-27
• 結(jié)果27-36
• 討論36-41
• 結(jié)論41-42
• 參考文獻(xiàn)42-46
• 致謝46-47
• 附錄47-59
• 附錄A 英文縮略詞表47-48
• 附錄B 常用試劑級配制48-49
• 附錄C 個人簡歷及發(fā)表論文49-50
• 附錄D 綜述50-59
• 參考文獻(xiàn)56-59

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本文編號：1023054