本文關(guān)鍵詞：PCBP1表達(dá)下調(diào)促進(jìn)LC3B表達(dá)上調(diào)和誘發(fā)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： PCBP1 LC3B 細(xì)胞自噬 SQSTM1/p62 癌癥

【摘要】：研究目的:Poly C binding protein 1(PCBP1)是一種分子質(zhì)量約為38 KD的核苷酸結(jié)合蛋白,廣泛參與細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控,主要包括前體m RNA的剪接、成熟m RNA穩(wěn)定性以及m RNA翻譯的增強(qiáng)或沉默等。目前研究表明PCBP1可能是一種抑癌基因,在結(jié)直腸癌、肺癌、宮頸癌、乳腺癌和肝癌組織中表達(dá)下調(diào),且其表達(dá)下調(diào)與上述腫瘤的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān)。卵巢癌作為女性三大惡性腫瘤(包括卵巢癌、宮頸癌、子宮癌)中最兇險(xiǎn)的惡性腫瘤,其發(fā)病機(jī)理還不十分清楚。PCBP1作為一個(gè)可能的抑癌基因,但關(guān)于PCBP1與卵巢癌的發(fā)生是否相關(guān)還不清楚,其具體的抑癌機(jī)制也還不十分清楚,急需進(jìn)一步的深入研究。最近,越來(lái)越多的研究表明細(xì)胞自噬與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及轉(zhuǎn)移耐藥等密切相關(guān)。一般認(rèn)為,在腫瘤發(fā)生初期,腫瘤血管還未生成,腫瘤細(xì)胞往往處于一種營(yíng)養(yǎng)匱乏和缺氧的狀態(tài)下,此時(shí)腫瘤細(xì)胞主要是依靠細(xì)胞自噬產(chǎn)生維持其正常代謝和生長(zhǎng)的必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如核苷酸、氨基酸和脂肪酸等。與此同時(shí),腫瘤細(xì)胞過(guò)度的細(xì)胞自噬又會(huì)導(dǎo)致自噬性細(xì)胞死亡。因此,本文試圖探討PCBP1在卵巢癌發(fā)生中的分子功能及其潛在的作用機(jī)理:首先我們?cè)谂R床卵巢癌樣本中探討PCBP1表達(dá)水平與卵巢癌發(fā)生進(jìn)展的相關(guān)性;其次在營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下,探討過(guò)表達(dá)PCBP1對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)存活和自噬誘導(dǎo)的影響,而后進(jìn)一步闡明PCBP1又是如何調(diào)控細(xì)胞自噬發(fā)生和影響腫瘤細(xì)胞存活的分子機(jī)制;最后,再通過(guò)臨床樣本驗(yàn)證PCBP1表達(dá)失調(diào)與卵巢癌組織細(xì)胞自噬水平的相關(guān)性,以期為PCBP1表達(dá)缺失引起的腫瘤診斷和治療提供新的治療思路。研究方法:1.利用卵巢癌組織芯片其中包括90例卵巢癌組織和10例卵巢癌癌旁組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)(IHC)研究PCBP1蛋白水平與卵巢癌發(fā)生進(jìn)展的相關(guān)性;2.利用CCK8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):首先研究無(wú)血清饑餓培養(yǎng)條件下,研究過(guò)表達(dá)PCBP1和自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)對(duì)A2780和DLD-1腫瘤細(xì)胞增殖的影響;進(jìn)一步利用Earle?s鹽平衡液(Earle?s balanced salts solution,EBSS)饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,再免疫印跡探討過(guò)表達(dá)PCBP1對(duì)饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬過(guò)程中LC3B蛋白表達(dá)及其I型向II型轉(zhuǎn)換的影響;3.細(xì)胞自噬流量研究,首先利用EBSS饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和CQ抑制自噬體降解,再應(yīng)用蛋白免疫印跡和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù),研究PCBP1對(duì)LC3B,p62蛋白水平和細(xì)胞自噬流量的影響;4.利用DMSO和放線菌素D分別處理細(xì)胞,8或12小時(shí)后提取總RNA,再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,然后用PCR的方法檢測(cè)LC3B m RNA的量,以研究PCBP1對(duì)LC3B蛋白表達(dá)的改變是否通過(guò)影響LC3B m RNA穩(wěn)定性而起作用;進(jìn)一步使用細(xì)胞自噬降解抑制劑CQ處理細(xì)胞,進(jìn)行蛋白免疫印跡,觀察LC3B蛋白的表達(dá)水平變化,并進(jìn)一步排除細(xì)胞自噬降解對(duì)LC3B蛋白表達(dá)的影響。5.利用EBSS饑餓處理或EBSS聯(lián)合CQ處理情況下,通過(guò)顯微鏡拍照觀察統(tǒng)計(jì)和應(yīng)用流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)PCBP1對(duì)腫瘤細(xì)胞死亡數(shù)目和比例的影響;同樣在EBSS饑餓處理或EBSS聯(lián)合CQ處理壓力條件下,通過(guò)蛋白免疫印跡檢測(cè)過(guò)表達(dá)PCBP1對(duì)C-Caspase 8、C-Caspase 3和C-PARP以及Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響,進(jìn)而在分子機(jī)制水平驗(yàn)證過(guò)表達(dá)PCBP1和細(xì)胞自噬抑制對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響;6.應(yīng)用相應(yīng)連續(xù)切片的卵巢癌組織芯片,利用免疫組織化學(xué)(IHC)進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞自噬降解底物SQSTM1/p62,并觀察SQSTM1/p62和PCBP1表達(dá)水平的相關(guān)性,以進(jìn)一步在卵巢癌臨床樣本中明確PCBP1與細(xì)胞自噬的關(guān)系。研究結(jié)果:1.首先我們證實(shí)了PCBP1在92.2%的卵巢癌臨床組織樣本中普遍的表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)(p0.0001),且其表達(dá)下調(diào)程度與卵巢癌的腫瘤分期(p0.0062)、臨床分期(p0.0317)以及轉(zhuǎn)移(p0.0177)均呈正相關(guān);2.過(guò)表達(dá)PCBP1在無(wú)血清培養(yǎng)條件下顯著抑制了在腫瘤細(xì)胞A2780和DLD-1的生長(zhǎng)(p0.001)。有趣的是,在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,通過(guò)細(xì)胞自噬抑制劑CQ處理,可以完全模擬PCBP1過(guò)表達(dá)造成的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效應(yīng);3.進(jìn)一步研究表明,在A2780和DLD-1腫瘤細(xì)胞中過(guò)表達(dá)PCBP1抑制了饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬流量;相反,利用特異性的sh RNA敲低PCBP1促進(jìn)了饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的流量。從機(jī)制方面顯示,PCBP1能夠抑制細(xì)胞自噬核心基因LC3B基因m RNA的穩(wěn)定性及其蛋白表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞自噬抑制;4.同時(shí)還表明,在營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下,過(guò)表達(dá)PCBP1通過(guò)上調(diào)C-Caspase 8、CCaspase 3和C-PARP活化形式以及下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡;5.IHC檢測(cè)SQSTM1/p62結(jié)果顯示,細(xì)胞自噬降解底物SQSTM1/p62在卵巢癌組織中同樣顯著表達(dá)下調(diào)(p0.002),但與卵巢癌的進(jìn)展無(wú)顯著相關(guān)性(p0.2);SQSTM1/p62與相應(yīng)的PCBP1蛋白表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)R2=0.506,p0.01),進(jìn)一步在卵巢癌臨床組織樣本中驗(yàn)證了PCBP1抑制腫瘤細(xì)胞自噬的生理功能;結(jié)論:本論文證實(shí)PCBP1在臨床卵巢癌組織樣品中表達(dá)下調(diào),且在臨床上進(jìn)一步驗(yàn)證PCBP1表達(dá)下調(diào)與卵巢癌組織的細(xì)胞自噬水平以及卵巢癌的發(fā)生進(jìn)展密切相關(guān),進(jìn)一步揭示了PCBP1表達(dá)下調(diào)通過(guò)增加細(xì)胞自噬相關(guān)基因LC3B m RNA穩(wěn)定性和其蛋白表達(dá),誘發(fā)細(xì)胞自噬,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞在饑餓條件下的存活的分子機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：PCBP1 LC3B 細(xì)胞自噬 SQSTM1/p62 癌癥
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.31
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-13
• 第一章 前言13-18
• 1.1 細(xì)胞自噬（Autophagy）與腫瘤發(fā)生13-15
• 1.2 PCBP蛋白家族15
• 1.3 PCBP1研究進(jìn)展綜述15-18
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑18-24
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備18-19
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑19-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-36
• 2.2.1 蛋白免疫印跡檢測(cè)24-28
• 2.2.2 細(xì)胞免疫熒光研究28-29
• 2.2.3 細(xì)胞增殖CCK8研究29-30
• 2.2.4 LC3B基因mRNA穩(wěn)定性研究30-32
• 2.2.5 流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)32-33
• 2.2.6 免疫組織檢測(cè)和評(píng)分33-36
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果36-58
• 3.1 PCBP1表達(dá)下調(diào)與人卵巢癌的發(fā)生進(jìn)展呈正相關(guān)36-37
• 3.2 過(guò)表達(dá)PCBP1抑制腫瘤細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)匱乏條件下的細(xì)胞增殖能力和LC3B的表達(dá)37-39
• 3.3 過(guò)表達(dá)PCBP1抑制EBSS饑餓誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬流量39-40
• 3.4 敲低PCBP1促進(jìn)EBSS饑餓誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬流量40-44
• 3.5 PCBP1抑制細(xì)胞自噬底物p62/SQSTM1的降解44-45
• 3.6 PCBP1降低LC3B基因mRNA穩(wěn)定性下調(diào)其蛋白表達(dá)45-49
• 3.7 過(guò)表達(dá)PCBP1促進(jìn)饑餓誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡49-51
• 3.8 PCBP1與卵巢癌臨床組織樣本中細(xì)胞自噬水平呈負(fù)相關(guān)51-52
• 3.9 小結(jié)52-58
• 第四章 討論58-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 縮略詞簡(jiǎn)表65-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷66-67
• 致謝67

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本文編號(hào)：1022967