本文關(guān)鍵詞：重組人HMGB1蛋白主動免疫對小鼠乳腺癌影響的初步評估

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【摘要】：背景：高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)是一種普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度保守的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白,參與DNA修復(fù)、重組、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄等多種生命活動。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,被釋放到細(xì)胞外的HMGB1明顯增多。胞外HMGB1通過與靶細(xì)胞上的受體TLRs或RAGE結(jié)合,激活一系列信號通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移,而HMGB1拮抗劑能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我們據(jù)此推測,以HMGB1蛋白制備的疫苗進(jìn)行主動免疫可能會影響宿主腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。本研究利用在原核系統(tǒng)表達(dá)、純化的重組人HMGB1蛋白作為免疫源并給予小鼠進(jìn)行主動免疫,繼而對免疫成功的小鼠乳腺癌移植瘤的生長情況做初步的評估。方法：首先,將本課題組成功構(gòu)建的含有人HMGB1基因的pET28a-HMGB1導(dǎo)入大腸桿菌BL21內(nèi),以乳糖(1g/L)誘導(dǎo)HMGB1蛋白表達(dá),通過SDS-PAGE及Western Blotting進(jìn)行檢測和鑒定。進(jìn)一步通過鎳柱親和層析系統(tǒng)分離純化重組的HMGB1蛋白。將純化的重組HMGB1蛋白與弗氏佐劑混合制備成疫苗,對BALB/c小鼠背部皮下多點注射進(jìn)行免疫,對照組小鼠給予等量PBS注射。用間接ELISA法檢測小鼠血清中抗HMGB1抗體效價。待抗體效價穩(wěn)定后,將4T1乳腺癌細(xì)胞接種于小鼠右腋皮下建立移植瘤模型。成瘤后,每隔兩天用游標(biāo)卡尺測量腫瘤組織的最長徑和最短徑計算相對腫瘤體積和相對腫瘤增殖率；采用雙抗體夾心ELISA測定不同時間點小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平。根據(jù)HMGB1免疫組小鼠和對照組小鼠的相對腫瘤體積、實體瘤重量、組織學(xué)觀察、抑瘤率等指標(biāo)來初步評估HMGB1主動免疫對乳腺癌移植瘤生長的影響。結(jié)果：SDS-PAGE及Western Blotting結(jié)果表明成功得到重組人HMGB1蛋白。以HMGB蛋白作為免疫源免疫雌性BALB/c小鼠后,小鼠血清中抗HMGB1抗體呈陽性,且隨著免疫次數(shù)的增加,抗體滴度逐漸升高,經(jīng)過6次免疫后,小鼠體內(nèi)抗HMGB1抗體效價逐漸趨于穩(wěn)定,對照組小鼠血清中抗HMGB1抗體為陰性。接種4T1乳腺癌細(xì)胞株后第六天,在HMGB1免疫組及對照組小鼠的接種部位可觸及不同程度大小的皮下瘤結(jié)節(jié),成瘤率100%。隨著接種時間的延長,兩組小鼠荷瘤體積逐漸地增大,HMGB1免疫組小鼠腫瘤生長速度快于對照組,實體瘤重量也高于對照組(2.337±0.3122g vs 1.997±0.2401g),抑瘤率為-17%。雙抗體夾心ELISA結(jié)果顯示,HMGB1免疫組小鼠荷瘤后,其血清中HMGB1表達(dá)水平明顯低于對照組。結(jié)論：以重組人HMGB1蛋白作為免疫源能夠有效地觸發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)。HMGB1主動免疫可顯著降低荷瘤小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平,但不能有效抑制4T1乳腺癌移植瘤的生長。我們的結(jié)果提示,通過主動免疫阻斷]HMGB1可能難以抑制惡性腫瘤的生長,HMGB1與腫瘤的關(guān)系需要進(jìn)一步探討。
【關(guān)鍵詞】：高遷移率族蛋白B1 乳腺癌 主動免疫 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-26
• 1.1 乳腺癌概述9-12
• 1.1.1 乳腺癌的研究進(jìn)展9-10
• 1.1.2 乳腺癌動物模型10-12
• 1.2 HMGB1的國內(nèi)外研究進(jìn)展12-23
• 1.2.1 HMGB1的分子結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.2 HMGB1的釋放13-16
• 1.2.3 HMGB1的作用受體16-17
• 1.2.4 HMGB1的生物學(xué)作用17-21
• 1.2.5 HMGB1與靶向治療21-23
• 1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗23-26
• 第二章 重組人HMGB1蛋白主動免疫對小鼠乳腺癌移植瘤生長的影響26-47
• 2.1 實驗材料26-27
• 2.1.1 實驗動物26
• 2.1.2 實驗試劑26-27
• 2.2 實驗方法27-36
• 2.2.1 重組人HMGB1蛋白的原核表達(dá)及純化27-30
• 2.2.2 重組人HMGB1蛋白主動免疫BALB/c小鼠及免疫效價測定30-31
• 2.2.3 皮下瘤模型評估HMGB1主動免疫對乳腺癌移植瘤生長的影響31-36
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)方法36-37
• 2.4 實驗結(jié)果37-47
• 2.4.1 重組人HMGB1蛋白的原核表達(dá)37
• 2.4.2 重組人HMGB1蛋白的分離純化37-38
• 2.4.3 HMGB1蛋白主動免疫BALB/c小鼠安全性初步評估38-40
• 2.4.4 BALB/c小鼠抗HMGB1血清效價檢測40-41
• 2.4.5 重組人HMGB1蛋白主動免疫降低了荷瘤小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平41-42
• 2.4.6 重組人HMGB1蛋白主動免疫對4T1乳腺癌移植瘤生長的影響42-44
• 2.4.7 脾臟指數(shù)44-45
• 2.4.8 荷瘤小鼠的腫瘤組織的病理學(xué)觀察45-46
• 2.4.9 結(jié)論46-47
• 第三章 討論與展望47-49
• 3.1 討論47-48
• 3.2 展望48-49
• 附錄49-56
• (一) 英文縮寫詞一覽表49-51
• (二) 主要儀器設(shè)備51-52
• (三) 實驗主要溶液配制52-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果63-64
• 致謝64

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本文編號：1022108