發(fā)布時(shí)間：2017-10-13 01:33

  本文關(guān)鍵詞：重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫對(duì)小鼠乳腺癌影響的初步評(píng)估

  更多相關(guān)文章： 高遷移率族蛋白B1 乳腺癌 主動(dòng)免疫 間接ELISA

【摘要】：背景：高遷移率族蛋白B1 (HMGB1)是一種普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)的高度保守的非組蛋白染色質(zhì)結(jié)合蛋白,參與DNA修復(fù)、重組、復(fù)制及轉(zhuǎn)錄等多種生命活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,被釋放到細(xì)胞外的HMGB1明顯增多。胞外HMGB1通過與靶細(xì)胞上的受體TLRs或RAGE結(jié)合,激活一系列信號(hào)通路,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移,而HMGB1拮抗劑能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。我們據(jù)此推測(cè),以HMGB1蛋白制備的疫苗進(jìn)行主動(dòng)免疫可能會(huì)影響宿主腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。本研究利用在原核系統(tǒng)表達(dá)、純化的重組人HMGB1蛋白作為免疫源并給予小鼠進(jìn)行主動(dòng)免疫,繼而對(duì)免疫成功的小鼠乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)情況做初步的評(píng)估。方法：首先,將本課題組成功構(gòu)建的含有人HMGB1基因的pET28a-HMGB1導(dǎo)入大腸桿菌BL21內(nèi),以乳糖(1g/L)誘導(dǎo)HMGB1蛋白表達(dá),通過SDS-PAGE及Western Blotting進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。進(jìn)一步通過鎳柱親和層析系統(tǒng)分離純化重組的HMGB1蛋白。將純化的重組HMGB1蛋白與弗氏佐劑混合制備成疫苗,對(duì)BALB/c小鼠背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫,對(duì)照組小鼠給予等量PBS注射。用間接ELISA法檢測(cè)小鼠血清中抗HMGB1抗體效價(jià)。待抗體效價(jià)穩(wěn)定后,將4T1乳腺癌細(xì)胞接種于小鼠右腋皮下建立移植瘤模型。成瘤后,每隔兩天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤組織的最長(zhǎng)徑和最短徑計(jì)算相對(duì)腫瘤體積和相對(duì)腫瘤增殖率；采用雙抗體夾心ELISA測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平。根據(jù)HMGB1免疫組小鼠和對(duì)照組小鼠的相對(duì)腫瘤體積、實(shí)體瘤重量、組織學(xué)觀察、抑瘤率等指標(biāo)來初步評(píng)估HMGB1主動(dòng)免疫對(duì)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響。結(jié)果：SDS-PAGE及Western Blotting結(jié)果表明成功得到重組人HMGB1蛋白。以HMGB蛋白作為免疫源免疫雌性BALB/c小鼠后,小鼠血清中抗HMGB1抗體呈陽(yáng)性,且隨著免疫次數(shù)的增加,抗體滴度逐漸升高,經(jīng)過6次免疫后,小鼠體內(nèi)抗HMGB1抗體效價(jià)逐漸趨于穩(wěn)定,對(duì)照組小鼠血清中抗HMGB1抗體為陰性。接種4T1乳腺癌細(xì)胞株后第六天,在HMGB1免疫組及對(duì)照組小鼠的接種部位可觸及不同程度大小的皮下瘤結(jié)節(jié),成瘤率100%。隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng),兩組小鼠荷瘤體積逐漸地增大,HMGB1免疫組小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度快于對(duì)照組,實(shí)體瘤重量也高于對(duì)照組(2.337±0.3122g vs 1.997±0.2401g),抑瘤率為-17%。雙抗體夾心ELISA結(jié)果顯示,HMGB1免疫組小鼠荷瘤后,其血清中HMGB1表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。結(jié)論：以重組人HMGB1蛋白作為免疫源能夠有效地觸發(fā)BALB/c小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫反應(yīng)。HMGB1主動(dòng)免疫可顯著降低荷瘤小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平,但不能有效抑制4T1乳腺癌移植瘤的生長(zhǎng)。我們的結(jié)果提示,通過主動(dòng)免疫阻斷]HMGB1可能難以抑制惡性腫瘤的生長(zhǎng),HMGB1與腫瘤的關(guān)系需要進(jìn)一步探討。
【關(guān)鍵詞】：高遷移率族蛋白B1 乳腺癌 主動(dòng)免疫 間接ELISA
【學(xué)位授予單位】：南京師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-9
• 第一章 緒論9-26
• 1.1 乳腺癌概述9-12
• 1.1.1 乳腺癌的研究進(jìn)展9-10
• 1.1.2 乳腺癌動(dòng)物模型10-12
• 1.2 HMGB1的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展12-23
• 1.2.1 HMGB1的分子結(jié)構(gòu)12-13
• 1.2.2 HMGB1的釋放13-16
• 1.2.3 HMGB1的作用受體16-17
• 1.2.4 HMGB1的生物學(xué)作用17-21
• 1.2.5 HMGB1與靶向治療21-23
• 1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)23-26
• 第二章 重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫對(duì)小鼠乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響26-47
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料26-27
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-36
• 2.2.1 重組人HMGB1蛋白的原核表達(dá)及純化27-30
• 2.2.2 重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫BALB/c小鼠及免疫效價(jià)測(cè)定30-31
• 2.2.3 皮下瘤模型評(píng)估HMGB1主動(dòng)免疫對(duì)乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響31-36
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法36-37
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-47
• 2.4.1 重組人HMGB1蛋白的原核表達(dá)37
• 2.4.2 重組人HMGB1蛋白的分離純化37-38
• 2.4.3 HMGB1蛋白主動(dòng)免疫BALB/c小鼠安全性初步評(píng)估38-40
• 2.4.4 BALB/c小鼠抗HMGB1血清效價(jià)檢測(cè)40-41
• 2.4.5 重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫降低了荷瘤小鼠血清中HMGB1表達(dá)水平41-42
• 2.4.6 重組人HMGB1蛋白主動(dòng)免疫對(duì)4T1乳腺癌移植瘤生長(zhǎng)的影響42-44
• 2.4.7 脾臟指數(shù)44-45
• 2.4.8 荷瘤小鼠的腫瘤組織的病理學(xué)觀察45-46
• 2.4.9 結(jié)論46-47
• 第三章 討論與展望47-49
• 3.1 討論47-48
• 3.2 展望48-49
• 附錄49-56
• (一) 英文縮寫詞一覽表49-51
• (二) 主要儀器設(shè)備51-52
• (三) 實(shí)驗(yàn)主要溶液配制52-56
• 參考文獻(xiàn)56-63
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及研究成果63-64
• 致謝64

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