發(fā)布時間：2017-10-12 05:34

  本文關(guān)鍵詞：外源性抑癌基因PDCD4在人肺癌細(xì)胞系的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞生長的影響

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【摘要】：目的：肺癌是當(dāng)今世界最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤之一,近年來其發(fā)病率和死亡率均有所上升。2008年流行病統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),肺癌發(fā)病年齡向年輕化發(fā)展,平均發(fā)病年齡提前了5～10歲。多年來,眾多研究人員和臨床醫(yī)師致力于肺癌的研究,使得肺癌在早期診斷以及綜合治療等諸多方面都有了顯著的提高。但是,肺癌的防治工作依然艱難,目前尚沒有一種令人滿意的治療方法,肺癌患者的總體治療效果以及遠(yuǎn)期預(yù)后均較差。近年來,基因治療因其具有高效、特異性和靶向性強的特點,受到越來越多學(xué)者的重視。目前肺癌基因治療的體外及臨床前試驗已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果,但要想在臨床中廣泛應(yīng)用,還需很長一段時間的努力。PDCD4是近年來發(fā)現(xiàn)的具有抑癌作用的基因,主要通過抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯、以及通過上調(diào)p21的表達(dá)等多種途徑抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。目前已有研究表明,肺癌細(xì)胞中存在PDCD4表達(dá)下調(diào)或缺失的現(xiàn)象,但是將外源性抑癌基因PDCD4導(dǎo)入肺癌細(xì)胞系能否成功表達(dá)?PDCD4表達(dá)后對肺癌的形態(tài)、生長周期等有何直接影響?這些都是非常值得探索的問題。本研究將外源性抑癌基因PDCD4導(dǎo)入肺癌細(xì)胞系,檢測其表達(dá)情況以及成功表達(dá)后對肺癌細(xì)胞形態(tài)、生長速率以及生長周期等方面的影響,以期為肺癌的基因治療提供相關(guān)依據(jù)。方法：1.利用PDCD4真核表達(dá)載體和空載體分別轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系,通過熒光顯微鏡觀察PDCD4轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系后細(xì)胞的生長以及形態(tài)變化。2.利用FQ-PCR和Western blot方法分別從RNA和蛋白水平檢測轉(zhuǎn)染后PDCD4在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況。3.通過細(xì)胞計數(shù)的方法,分析轉(zhuǎn)染PDCD4后肺癌細(xì)胞生長速率的變化。4.流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染PDCD4后,肺癌細(xì)胞生長周期的變化。結(jié)果：1.外源性PDCD4 mRNA和蛋白在肺癌細(xì)胞系中均成功表達(dá)(1) 用FQ-PCR的方法檢測PDCD4mRNA的表達(dá),三次重復(fù)實驗結(jié)果如下,以未轉(zhuǎn)染的肺癌A549細(xì)胞系中mRNA的表達(dá)量作為歸一化標(biāo)準(zhǔn)(1),A549-PDCD4細(xì)胞中PDCD4 mRNA的表達(dá)量分別為45.99±8.705、27.82±6.114、48.35±2.024, A549-vector中PDCD4 mRNA表達(dá)量為0.4628±4.67E-2、0.3252±6.40E-2、0.4679±1.718E-2。可見,PDCD4mRNA在A549-PDCD4細(xì)胞中的表達(dá)量要遠(yuǎn)大于A549-vector田胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)量,且將三次重復(fù)實驗組間數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較(α校正為0.05/3=0.017),結(jié)果顯示,P值均大于0.017,無統(tǒng)計學(xué)差異。說明外源性PDCD4在肺癌細(xì)胞系中得到了穩(wěn)定表達(dá)。(2)用Western blot方法檢測PDCD4蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染空載體的肺癌細(xì)胞中PDCD4蛋白表達(dá)較低,而轉(zhuǎn)染PDCD4的肺癌細(xì)胞中檢測到高水平的PDCD4,也說明外源性PDCD4基因在肺癌細(xì)胞系中得到了穩(wěn)定表達(dá)。2.外源性PDCD4的表達(dá)能夠改變肺癌細(xì)胞形態(tài)未進(jìn)行轉(zhuǎn)染及空載體轉(zhuǎn)染的肺癌細(xì)胞生長良好,形態(tài)正常。細(xì)胞呈不規(guī)則形狀,胞體有多個突起,胞漿中可見細(xì)顆粒。PDCD4表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞,其細(xì)胞數(shù)量和形態(tài)發(fā)生明顯改變：細(xì)胞數(shù)量較對照組明顯減少,大部分細(xì)胞體積減小,突起消失,形態(tài)變圓。3.外源性PDCD4的表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞生長速率轉(zhuǎn)染前一日,將肺癌細(xì)胞以每孔5×105的數(shù)量接種到六孔板中。轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系48h后,分別對未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染空載體以及PDCD4這三種肺癌細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。三次重復(fù)實驗結(jié)果如下：A549-PDCD4:5.27×105±0.68×105; A549-vector: 8.90×105±0.40×105; A549:9.40×105±0.79×105。將三次重復(fù)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,(α校正為0.05/3=0.017),結(jié)果顯示A549-PDCD4細(xì)胞計數(shù)較另兩組細(xì)胞均顯著減小(P0.017),而A549-vector細(xì)胞與A549細(xì)胞計數(shù)不存在統(tǒng)計學(xué)差異(P0.017)�？梢娹D(zhuǎn)染外源性PDCD4基因?qū)?xì)胞生長速率起到顯著抑制作用。4.外源性PDCD4的表達(dá)能夠阻斷肺癌細(xì)胞生長周期為了探討PDCD4對肺癌細(xì)胞生長周期的影響,我們將細(xì)胞經(jīng)PI染色后用流式細(xì)胞術(shù)檢測,結(jié)果顯示,A549-PDCD4細(xì)胞GOG1期細(xì)胞比例(79.92%±2.72%)較A549-vector細(xì)胞(67.7%±4.56%)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549(69.52%+3.76%)明顯增多(P0.017),空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.017)。而A549-PDCD4細(xì)胞S+G2M期細(xì)胞比例(20.07%±1.91%)較A549-vector細(xì)胞(32.3%±2.37%)和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞A549(30.48%±4.86%)明顯降低(P0.017),同樣,空載體組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞差異不明顯(P0.017)。說明外源性PDCD4(?)夠干擾肺癌A549細(xì)胞周期,使大多數(shù)細(xì)胞周期阻滯在GOG1期,抑制細(xì)胞增殖。結(jié)論：PDCD4能夠改變肺癌細(xì)胞形態(tài)、抑制生長速率、阻斷細(xì)胞生長周期,這可能是PDCD4抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的重要機制之一。進(jìn)一步明確了PDCD4在肺癌發(fā)生發(fā)展中扮演的重要角色,為將來以PDCD4為靶點進(jìn)行基因治療提供了重要的實驗依據(jù),開辟了新的思路。隨著PDCD4等抑癌基因的不斷發(fā)現(xiàn),基因治療必將成為惡性腫瘤治療方法中的重要組成部分,在防治腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等方面發(fā)揮重要作用,具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：肺癌 PDCD4 抑癌基因
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2
【目錄】：

• 中文摘要10-13
• 英文摘要13-17
• 符號說明17-18
• 第一章 前言18-23
• 1 肺癌的流行病學(xué)調(diào)查現(xiàn)狀18
• 2 肺癌的病因及發(fā)病機制18-19
• 3 肺癌的治療方法19-21
• 3.1 手術(shù)治療19
• 3.2 放射治療19-20
• 3.3 化學(xué)藥物治療20
• 3.4 免疫治療20-21
• 3.5 基因治療21
• 4 PDCD4與肺癌發(fā)生的關(guān)系21-22
• 5 研究目的和意義22-23
• 第二章 綜述 抑癌基因PDCD4的研究進(jìn)展23-29
• 1 PDCD4基因的發(fā)現(xiàn)及其結(jié)構(gòu)特點23
• 2 PDCD4基因的生物學(xué)特性23-24
• 3 PDCD4與腫瘤發(fā)生的關(guān)系24-26
• 3.1 PDCD4與肺癌24
• 3.2 PDCD4與食管癌24-25
• 3.3 PDCD4與大腸癌25
• 3.4 PDCD4與肝癌25-26
• 3.5 PDCD4與卵巢癌26
• 4 PDCD4基因的抑癌機制26-27
• 4.1 PDCD4基因能夠抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄26
• 4.2 PDCD4基因能夠抑制腫瘤細(xì)胞的翻譯26-27
• 4.3 PDCD4基因通過使p21的表達(dá)上調(diào)抑制腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化27
• 5 PDCD4對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響27-29
• 5.1 PDCD4對細(xì)胞周期的影響27-28
• 5.2 PDCD4對細(xì)胞凋亡的影響28-29
• 第三章 材料與方法29-40
• 1 細(xì)胞株29
• 2 肺癌細(xì)胞系培養(yǎng)29
• 2.1 試劑與材料29
• 2.2 主要儀器設(shè)備及其他29
• 2.3 實驗方法29
• 3 外源性PDCD4轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系29-30
• 3.1 試劑與材料29-30
• 3.2 主要儀器設(shè)備及其他30
• 3.3 試驗方法30
• 4 實時熒光定量PCR30-33
• 4.1 試劑與材料30-31
• 4.2 主要儀器設(shè)備及其他31
• 4.3 實驗方法31-33
• 5 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)33-38
• 5.1 試劑與材料33-34
• 5.2 主要儀器設(shè)備及其他34-35
• 5.3 實驗方法35-38
• 6 用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期38-40
• 6.1 試劑與材料38
• 6.2 儀器設(shè)備38
• 6.3 實驗步驟38-40
• 第四章 結(jié)果40-45
• 1 外源性PDCD4基因在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中的表達(dá)40-41
• 1.1 熒光顯微鏡下觀察外源性PDCD4基因的轉(zhuǎn)染情況40
• 1.2 檢測外源性PDCD4 mRNA在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平40-41
• 1.3 檢測外源性PDCD4蛋白在肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平41
• 2 外源性PDCD4表達(dá)對肺癌細(xì)胞形態(tài)的影響41-43
• 3 外源性PDCD4表達(dá)對肺癌細(xì)胞生長速率的影響43
• 4 外源性PDCD4表達(dá)對肺癌細(xì)胞周期的影響43-45
• 第五章 討論45-48
• 第六章 結(jié)論48-50
• 1 結(jié)論48
• 2 研究的創(chuàng)新之處48
• 3 研究的局限和不足48
• 4 研究感悟48-50
• 附表50-51
• 參考文獻(xiàn)51-58
• 致謝58-60
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄60-61
• 學(xué)位論文評閱及答辯情況表61

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本文編號：1016939