本文關鍵詞：氯化鈷對Walker256細胞HSP90的表達及其抑制劑17-AAG對細胞凋亡和生長影響

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【摘要】：目的觀察氯化鉆(CoCl2)在體外模擬低氧對肝癌Walker256細胞形態(tài)的改變及增殖能力的影響,進一步確立合適的肝癌Walker256細胞的體外缺氧模型。并在該缺氧模型基礎上觀察不同程度缺氧對肝癌Walker256細胞中HSP90蛋白的表達能力的影響,并探討可能的影響機制。方法1.倒置顯微鏡法觀察不同濃度的CoCl2 (0、50、100、200、300、500nmol/L)和不同濃度的17-AAG (0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分別處理肝癌Walker256細胞48h后,觀察其細胞形態(tài)的改變。2.MTT法測定不同濃度COCl2 (0、50、100、200、300、500timol/L)和不同濃度的17-AAG抑制劑(0、0.1、0.25、0.5、1.2μmol/L)分別經不同的時間段處理肝癌Walker256細胞,來檢測其增殖能力的影響。3.蛋白免疫印跡(Western Blot)法分別檢測不同濃度的CoCl2 (0、50、100、200、300、 500μmol/L)和0.5μmol/L 17-AAG作用于Walker256細胞后,對細胞中HSP90及Bcl-2表達的影響。4.Annexin- FITC/PI流式細胞雙染技術檢測17-AAG對肝癌Walker256細胞的凋亡的影響。5.用Walker256細胞的細胞懸液建立大鼠種植瘤模型,并將成瘤實驗大鼠分為經腹腔給予17-AAG和不給予17-AAG兩組(各組15只大鼠),觀測比較兩組大鼠種植瘤的平均體積。結果1.不同濃度的CoCl2對細胞具有一定程度的增殖抑制作用。300μmol/L和500μmol/L CoCl2作用于細胞,鏡下觀察可見大量細胞碎片,細胞膜出現明顯的皺縮。Western Blot結果顯示CoCl2處理細胞48h后,能夠上調HSP90的表達,該作用具有濃度依賴性。2.不同濃度的HSP90抑制劑17-AAG對Walker256細胞的增殖抑制作用具有時間和劑量的依賴性。17-AAG對細胞形態(tài)也有影響,對照組Walker256細胞飽滿呈圓形,胞質豐富,大小均一,包膜完整,而經17-AAG作用48 h后的Walker256細胞則明顯減少,細胞邊緣模糊、形態(tài)差,部分細胞包膜破裂。Annexin-FITC/PI染色法檢測分析結果顯示：①與常氧組相比低氧組細胞凋亡比率無明顯差異(P0.05)；②與常氧組相比較17-AAG+常氧組細胞凋亡比率增加(P0.05)；③與低氧組相比17-AAG+低氧組細胞凋亡比率增加(P0.05)；④與17-AAG+低氧組相比17-AAG+常氧組細胞凋亡比率增加((P0.05)。同時通過Wester Blot檢測分析結果顯示：①與常氧組相比,低氧組的HSP90和Bcl-2表達增強(P0.05)；②與常氧組相比,17-AAG+常氧組的HSP90和Bcl-2表達受到抑制(P0.05)；③與低氧組相比,17-AAG+低氧組的HSP90和Bcl-2表達也受到抑制(P0.05)；④17-AAG+低氧組與17-AAG+常氧組相比,HSP90和Bcl-2的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.17-AAG抑制劑能夠明顯抑制大鼠種植瘤的生長,隨著給藥時間的延長,發(fā)現給藥組大鼠種植瘤生長較對照組明顯緩慢,對照組大鼠種瘤平均體積始終呈增長的趨勢。結論1.不同濃度的CoCl2能誘導HSP90的表達,當CoCI2在200μmol/L的劑量時誘導作用最為明顯。2.HSP90抑制劑17-AAG能夠明顯抑制大鼠種植瘤的生長。3.HSP90抑制劑17-AAG能夠明顯的促進細胞凋亡的發(fā)生,因而推測其機制可能是17-AAG與HSP90結合后,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達,從而使腫瘤凋亡明顯增加。
【關鍵詞】：低氧 Walker256細胞 HSP90 HSP90抑制劑17-AAG
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要2-4
• Abstract4-10
• 英文縮略詞表10-12
• 前言12-15
• 材料與方法15-23
• 1. 材料試劑與主要的儀器設備15-17
• 1.1 實驗材料與儀器15
• 1.2 主要的試劑與抗體15-16
• 1.3 主要的實驗儀器16
• 1.4 試劑的配制16-17
• 2. 細胞的處理17-18
• 2.1 細胞的復蘇17-18
• 2.2 細胞的換液與傳代18
• 2.3 細胞的凍存18
• 3. MTT法測定細胞增殖能力的影響18-19
• 3.1 實驗分組18-19
• 3.2 實驗步驟19
• 3.3 倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)19
• 4. Western Blot檢測分析19-22
• 4.1 細胞總蛋白的提取19-20
• 4.2 細胞總蛋白含量的測定(BCA法)20
• 4.3 灌膠與上樣20-21
• 4.4 電泳21
• 4.5 轉膜21
• 4.6 免疫反應21
• 4.7 顯影、定影21-22
• 4.8 凝膠圖像分析22
• 5. 細胞凋亡觀察與檢測22
• 6. 大鼠種植瘤模型的建立22
• 7. 統(tǒng)計學分析22-23
• 結果23-33
• 1. 氯化鈷對細胞形態(tài)學的影響23-24
• 2. 氯化鈷對細胞增殖能力的變化24-25
• 3. 低氧環(huán)境下CoCl_2誘導HSP90的表達25-26
• 4. HSP90抑制劑17-AAG對細胞的增殖抑制作用26-27
• 5. 17-AAG對Walker256細胞形態(tài)的影響27-28
• 6. 低氧環(huán)境下17-AAG對Walker256細胞凋亡的影響28-30
• 7. 17-AAG對Walker256細胞HSP90和Bcl-2蛋白表達的影響30-31
• 8. 大鼠種植瘤模型的建立31
• 9. 給予17-AAG后對照組和給藥組大鼠腫瘤的生長情況31-33
• 討論33-38
• 1. HSP90基因結構與功能33-34
• 2. HSP90在腫瘤中的作用34-35
• 3. 低氧可誘導HSP90的表達35
• 4. HSP90抑制劑17-AAG的作用及干預實驗35-38
• 結論38-39
• 參考文獻39-42
• 綜述：熱休克蛋白90與惡性腫瘤的研究進展42-50
• 1、HSP90的結構及生物學特性42
• 2、HSP90的功能42-43
• 3、HSP90與腫瘤的關系43
• 4、HSP90與腫瘤耐藥性43-44
• 5、HSP90在腫瘤治療中的應用44-46
• 6、展望46-47
• 參考文獻47-50
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄50-51
• 致謝51-52

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