本文關鍵詞：骨橋蛋白（OPN）在TLR2信號通路介導的腫瘤細胞浸潤與轉移中作用機制的研究

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【摘要】：乳腺癌是女性中發(fā)病率高，危害大的癌癥之一，嚴重影響女性的身心健康。治療乳腺癌的難點在于乳腺癌細胞具有很強的浸潤與轉移能力，這也是造成乳腺癌患者死亡率高的主要原因。因此對乳腺癌細胞浸潤與轉移機制的深入研究，對乳腺癌的預防以及臨床治療具有重要意義。 骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種磷酸化糖蛋白，它可以在胞內發(fā)揮作用，也可以分泌到細胞外發(fā)揮其生理功能。OPN可以參與到許多生理病理過程中，如炎癥反應，免疫反應，細胞凋亡等。也可通過與細胞表面的特異性受體結合，介導腫瘤細胞的粘附、浸潤與轉移。但是，目前對OPN在腫瘤細胞中的作用機制還不清楚，需要更深入的研究。 TLR（Toll-like receptors，Toll樣受體）是一類在人體內廣泛存在的并且高度保守的重要的模式識別受體，能夠識別并結合病原相關分子模式（PAMP），在天然免疫反應中發(fā)揮重要的作用。近來研究表明，多種腫瘤細胞中也有TLR表達，，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及浸潤與轉移具有一定相關性，但目前對其作用機制尚不清楚。 實驗室前期研究發(fā)現，TLR2和OPN在兩種乳腺癌細胞MCF-7（低轉移乳腺癌細胞）和MDA-MB-231（高轉移乳腺癌細胞）中存在差異性表達， MCF-7細胞中OPN和TLR2的表達均低于MDA-MB-231。還有研究表明TLR2和OPN分別在乳腺癌細胞的浸潤轉移中起促進作用，那么TLR2對乳腺癌細胞的浸潤與轉移作用是否與OPN有關系呢？二者又是通過什么機制相互作用的呢？為了解決以上疑問，本實驗選取MDA-MB-231細胞（高轉移的乳腺癌細胞）為研究對象，通過Pam3CSK4（TLR1-TLR2二聚體的激活劑）和LTA（TLR2的激活劑）激活TLR2信號通路，研究OPN的表達變化情況，進而研究TLR2與OPN在腫瘤浸潤與轉移中的作用機制，為乳腺癌的臨床治療提供理論依據。 本論文利用MTT法、細胞創(chuàng)口愈合實驗、Transwell基質膠細胞侵襲實驗以及軟瓊脂克隆形成實驗等技術手段，檢測了Pam3CSK4和LTA對乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖、遷移、侵襲及非錨定生長能力的影響。結果表明，Pam3CSK4和LTA的刺激能夠促進MDA-MB-231細胞的增殖、浸潤與遷移能力。 利用實時定量PCR技術檢測了乳腺癌細胞MDA-MB-231在Pam3CSK4和LTA刺激后TLR2和OPN各亞型的基因表達變化。結果顯示，Pam3CSK4和LTA的刺激均能顯著提高TLR2基因的表達，且二者的刺激能夠顯著上調OPN各亞型基因的表達。ELISA檢測表明，Pam3CSK4和LTA刺激對iOPN和sOPN蛋白的表達具有明顯上調作用。 利用腫瘤轉移PCR芯片技術對腫瘤轉移相關的84個基因的表達情況進行分析。結果表明Pam3CSK4和LTA刺激乳腺癌細胞MDA-MB-231后，影響腫瘤轉移相關基因的表達。 綜上所述，本實驗對OPN介導的TLR2信號通路對乳腺癌細胞MDA-MB-231浸潤與轉移影響的作用機制進行了初步研究，并通過腫瘤轉移PCR芯片檢測了刺激后腫瘤轉移相關基因的差異表達，為癌細胞浸潤與轉移機制的研究提供了新思路，為乳腺癌的臨床檢測和治療提供了基礎資料。
【關鍵詞】：骨橋蛋白（OPN） Toll樣受體2 乳腺癌細胞 Pam3CSK4 LTA
【學位授予單位】：山東師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R730.2
【目錄】：

• 目錄4-6
• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 綜述10-20
• 1. 骨橋蛋白（OPN）的結構特征10-13
• 2. 骨橋蛋白（OPN）與天然免疫13-15
• 3. 骨橋蛋白（OPN）與細胞介導的免疫反應15-18
• 4. 骨橋蛋白（OPN）與腫瘤的發(fā)展和轉移18
• 5. 總結與展望18-20
• 前言20-24
• 第一章 PAM3CSK4 和 LTA 刺激對人乳腺癌細胞轉移侵襲能力的影響24-35
• 1．實驗材料與試劑24-25
• 2．實驗方法25-29
• 2.1 人乳腺癌細胞株培養(yǎng)25
• 2.2 細胞增殖活力檢測25-26
• 2.3 細胞創(chuàng)口愈合實驗26-27
• 2.4 Transwell 基質膠細胞侵襲實驗27-28
• 2.5 軟瓊脂克隆形成實驗28-29
• 3．實驗結果29-34
• 3.1 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對人乳腺癌細胞增殖活力的影響29-31
• 3.2 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對 MDA-MB-231 細胞遷移能力的影響31-32
• 3.3 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對 MDA-MB-231 細胞侵襲能力的影響32-33
• 3.4 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對 MDA-MB-231 細胞非錨定生長能力的影響33-34
• 4. 本章小結34-35
• 第二章 PAM3CSK4 和 LTA 刺激對 OPN、TLR2 表達的影響35-43
• 1. 實驗材料與試劑35-36
• 2. 實驗方法36-40
• 2.1 利用 Trizol 法提取 MDA-MB-231 細胞的總 RNA36-37
• 2.2 反轉錄37-38
• 2.3 實時定量 PCR（Real-time PCR）38-39
• 2.4 酶聯免疫吸附實驗（ELISA）39-40
• 3．實驗結果40-42
• 3.1 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對 OPN 各亞型以及 TLR2 基因表達的影響40-41
• 3.2 Pam3CSK4 和 LTA 刺激對 MDA-MB-231 細胞中 OPN 蛋白表達的影響41-42
• 4. 本章小結42-43
• 第三章 利用腫瘤轉移 PCR 芯片檢測 PAM3CSK4 和 LTA 刺激后乳腺癌細胞中腫瘤轉移相關基因的表達變化43-61
• 1．實驗材料與試劑43-44
• 2．實驗方法44-49
• 2.1 Pam3CSK4 和 LTA 刺激乳腺癌細胞 MDA-MB-23144
• 2.2 總 RNA 提取44-45
• 2.3 RNA 質量檢測45-46
• 2.4 cDNA 合成46-48
• 2.5 實時定量 PCR（Real-Time PCR）48-49
• 2.6 結果數據分析49
• 3．實驗結果49-60
• 3.1 RNA 完整性程度的檢測49-51
• 3.2 對 PCR 產物的特異性分析51-52
• 3.3 腫瘤轉移 PCR 芯片分析52-60
• 4. 本章小結60-61
• 討論61-64
• 結論64-65
• 參考文獻65-73
• 附錄 1 主要儀器設備73-74
• 附錄 2 英文縮寫詞74-75
• 致謝75

【共引文獻】

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