本文關(guān)鍵詞：蟲(chóng)草素誘導(dǎo)人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡與自噬及其機(jī)理的研究

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【摘要】：蟲(chóng)草素是蟲(chóng)草屬中一種主要的生物活性物質(zhì),近年來(lái)被報(bào)道具有多種生理活性,例如,抗腫瘤、抗衰老、抗病毒、抗真菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等。目前,蟲(chóng)草素主要通過(guò)提取純化獲得,其中純化方式主要有：離子交換樹(shù)脂法和大孔樹(shù)脂法,雖然二者都具有較理想的純化效果,但回收率低,不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。此外,研究表明,蟲(chóng)草素可抑制多種腫瘤的生長(zhǎng)增殖并誘導(dǎo)其凋亡,然而關(guān)于蟲(chóng)草素對(duì)人類非小細(xì)胞肺癌的作用效果及其作用機(jī)理的研究目前還很少。本課題以九州蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基為原料,對(duì)蟲(chóng)草素的提取純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化和改進(jìn),首先探究了不同乙醇濃度對(duì)蟲(chóng)草素提取量的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蟲(chóng)草素的提取量在乙醇濃度為80%時(shí)達(dá)到最高；然后比較了AB-8大孔樹(shù)脂和酸性氧化鋁對(duì)蟲(chóng)草素的純化效果,數(shù)據(jù)分析表明,經(jīng)兩種柱填料純化后蟲(chóng)草素的純度相近,均可達(dá)到35%左右；但是蟲(chóng)草素的得率差別很大,使用AB-8進(jìn)行純化,蟲(chóng)草素得率最高可達(dá)36.78%,而酸性氧化鋁純化后蟲(chóng)草素得率可高達(dá)83.67%；因此,我們最終選擇酸性氧化鋁作為柱料對(duì)蟲(chóng)草素進(jìn)行純化,并進(jìn)行了生產(chǎn)工藝的公斤級(jí)驗(yàn)證,1000g蟲(chóng)草大米培養(yǎng)基可得到純度為98.20%的蟲(chóng)草素0.89g,蟲(chóng)草素總回收率為39.83%。本課題研究了蟲(chóng)草素抗人類非細(xì)胞肺癌的活性。首先,選用SRB法檢測(cè)了蟲(chóng)草素對(duì)A549、H1792、H1299、H460和H157的抑制作用,處理時(shí)間分別為24h和48h；結(jié)果顯示,H1299、H460和H157對(duì)蟲(chóng)草素較為敏感,并且抑制率隨著蟲(chóng)草素作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。然后,對(duì)蟲(chóng)草素處理后的H460和H1299細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)和Western blot分析,流式結(jié)果表明,使用200μM蟲(chóng)草素處理24h后,H460和H1299的凋亡率可分別達(dá)到29.39%和36.55%；Western blot結(jié)果顯示,蟲(chóng)草素可明顯增強(qiáng)Caspase8、Caspase9、Caspase3和PARP的切割水平,并呈時(shí)間和濃度依賴效應(yīng),這表明在人類NSCLC細(xì)胞中,蟲(chóng)草素可誘導(dǎo)Caspase途徑依賴的細(xì)胞凋亡。細(xì)胞中促凋亡蛋白Noxa、Bax表達(dá)水平的增加和抗凋亡蛋白Mcl-1、Bcl-2表達(dá)水平的降低,表明蟲(chóng)草素可通過(guò)線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源通路誘導(dǎo)凋亡；c-FLIP是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)控因子,可通過(guò)抑制Caspase8的活化來(lái)抑制外源凋亡通路,蟲(chóng)草素可顯著降低c-FLIPL的表達(dá)量,而且c-FLIPL的過(guò)表達(dá)可緩解蟲(chóng)草素對(duì)人類NSCLC細(xì)胞的抑制作用,促進(jìn)細(xì)胞的存活,這表明蟲(chóng)草素可通過(guò)外源通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。mTOR信號(hào)途徑可促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖并且對(duì)自噬具有負(fù)調(diào)控作用,在腫瘤細(xì)胞中mTOR途徑被過(guò)度活化。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)草素可降低人類NSCLC細(xì)胞中mTOR下游蛋白4E-BP1和S6K1的磷酸化水平,抑制mTOR途徑的活化,進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。LC3II表達(dá)量上調(diào)和p62表達(dá)量下調(diào)表明蟲(chóng)草素可誘導(dǎo)人類NSCLC細(xì)胞發(fā)生自噬；我們推測(cè)蟲(chóng)草素可通過(guò)抑制mTOR信號(hào)途徑來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。我們還檢測(cè)了蟲(chóng)草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)凋亡的作用,使用Atg5 knockdown和LY294002來(lái)抑制自噬,然后Western blot和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)蟲(chóng)草素處理后細(xì)胞的凋亡水平,結(jié)果一致表明蟲(chóng)草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。總而言之,我們發(fā)現(xiàn)了蟲(chóng)草素抗腫瘤的新機(jī)制,希望可以為蟲(chóng)草素應(yīng)用于人類非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供新的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：蟲(chóng)草素 人類非小細(xì)胞肺癌 細(xì)胞自噬 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2
【目錄】：

• 摘要14-16
• ABSTRACT16-18
• 符號(hào)說(shuō)明18-20
• 第一章 前言20-38
• 1.1 蟲(chóng)草素研究進(jìn)展20-25
• 1.1.1 蟲(chóng)草素的理化性質(zhì)20
• 1.1.2 蟲(chóng)草素的主要獲得途徑20-21
• 1.1.2.1 蟲(chóng)草素的化學(xué)合成20-21
• 1.1.2.2 天然蟲(chóng)草素的提取21
• 1.1.3 蟲(chóng)草素的分離純化21-22
• 1.1.3.1 AB-8大孔樹(shù)脂簡(jiǎn)介21-22
• 1.1.3.2 酸性氧化鋁簡(jiǎn)介22
• 1.1.4 蟲(chóng)草素的檢測(cè)方法22
• 1.1.5 蟲(chóng)草素生理活性簡(jiǎn)介22-25
• 1.1.5.1 增強(qiáng)免疫力作用22-23
• 1.1.5.2 抗菌、抗病毒作用23
• 1.1.5.3 抗腫瘤作用23-25
• 1.1.5.4 其它作用25
• 1.2 非小細(xì)胞肺癌的研究現(xiàn)狀25-28
• 1.2.1 肺癌的發(fā)生25-26
• 1.2.2 非小細(xì)胞肺癌的分類26-27
• 1.2.3 非小細(xì)胞肺癌治療現(xiàn)狀27-28
• 1.3 細(xì)胞凋亡28-32
• 1.3.1 細(xì)胞凋亡與腫瘤28-29
• 1.3.2 細(xì)胞凋亡的主要信號(hào)途徑29-31
• 1.3.2.1 細(xì)胞外源凋亡途徑29-30
• 1.3.2.2 細(xì)胞內(nèi)源凋亡途徑30-31
• 1.3.3 c-FLIP在細(xì)胞凋亡中的作用31-32
• 1.4 mTOR信號(hào)通路32-33
• 1.4.1 mTOR信號(hào)通路的組成32
• 1.4.2 mTOR的生物學(xué)功能32-33
• 1.5 細(xì)胞自噬33-35
• 1.5.1 細(xì)胞自噬及其發(fā)生過(guò)程33-34
• 1.5.2 細(xì)胞自噬與腫瘤34-35
• 1.5.2.1 自噬與腫瘤存活34-35
• 1.5.2.2 自噬與腫瘤抑制35
• 1.6 細(xì)胞凋亡與自噬35-36
• 1.6.1 凋亡與自噬共同促進(jìn)細(xì)胞死亡35
• 1.6.2 自噬抑制凋亡35-36
• 1.6.3 自噬促進(jìn)凋亡36
• 1.7 本課題的研究?jī)?nèi)容和意義36-38
• 第二章 蟲(chóng)草素純化工藝的優(yōu)化38-48
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料38-39
• 2.1.1 藥品和試劑38
• 2.1.1.1 藥品38
• 2.1.1.2 試劑38
• 2.1.2 儀器與耗材38-39
• 2.1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器38-39
• 2.1.2.2 實(shí)驗(yàn)耗材39
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法39-41
• 2.2.1 蟲(chóng)草素的提取39
• 2.2.2 蟲(chóng)草素的純化39-40
• 2.2.3 蟲(chóng)草素結(jié)晶與重結(jié)晶40
• 2.2.4 蟲(chóng)草素的純度與結(jié)構(gòu)檢測(cè)40-41
• 2.2.4.1 紫外光譜測(cè)定40
• 2.2.4.2 高效液相色譜檢測(cè)40-41
• 2.2.4.3 紅外圖譜測(cè)定41
• 2.2.4.4 核磁共振分析41
• 2.2.4.5 質(zhì)譜分析41
• 2.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果41-47
• 2.3.1 不同乙醇濃度對(duì)蟲(chóng)草素提取量的影響41-42
• 2.3.2 不同乙醇濃度對(duì)蟲(chóng)草素洗脫效果的影響42-44
• 2.3.3 蟲(chóng)草素提取工藝的驗(yàn)證44
• 2.3.4 蟲(chóng)草素純品的純度檢測(cè)和結(jié)構(gòu)鑒定44-47
• 2.4 本章小結(jié)與討論47-48
• 第三章 蟲(chóng)草素誘導(dǎo)人類非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡及其機(jī)理的研究48-66
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料48-52
• 3.1.1 細(xì)胞株48
• 3.1.2 藥品和試劑48-49
• 3.1.2.1 藥品49
• 3.1.2.2 試劑49
• 3.1.3 儀器和耗材49-50
• 3.1.3.1 主要儀器49-50
• 3.1.3.2 主要耗材50
• 3.1.4 溶液及試劑配方50-52
• 3.1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑和配方50
• 3.1.4.2 蛋白裂解試劑和配方50-51
• 3.1.4.3 Western blot所用試劑和配方51-52
• 3.1.4.4 其它試劑和配方52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法52-57
• 3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)52-53
• 3.2.1.1 細(xì)胞傳代52-53
• 3.2.1.2 細(xì)胞接種53
• 3.2.1.3 細(xì)胞凍存53
• 3.2.1.4 復(fù)蘇細(xì)胞53
• 3.2.2 SRB染色測(cè)定細(xì)胞存活率53-54
• 3.2.3 Western Blot54-56
• 3.2.3.1 提取細(xì)胞總蛋白54
• 3.2.3.2 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度54-55
• 3.2.3.3 Western blot檢測(cè)55-56
• 3.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡56-57
• 3.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析57
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-64
• 3.3.1 蟲(chóng)草素能抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖57
• 3.3.2 蟲(chóng)草素能誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞發(fā)生Caspase依賴的凋亡57-60
• 3.3.3 蟲(chóng)草素通過(guò)內(nèi)源途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡60-62
• 3.3.4 蟲(chóng)草素通過(guò)外源途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡62-64
• 3.4 本章小結(jié)與討論64-66
• 第四章 蟲(chóng)草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡關(guān)系的研究66-74
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料66-67
• 4.1.1 細(xì)胞株66
• 4.1.2 藥品與試劑66-67
• 4.1.2.1 藥品66
• 4.1.2.2 試劑66-67
• 4.1.3 儀器與耗材67
• 4.1.4 試劑與溶劑配方67
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法67-68
• 4.2.1 siRNA轉(zhuǎn)染67
• 4.2.2 其它實(shí)驗(yàn)方法67-68
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果68-72
• 4.3.1 蟲(chóng)草素可抑制NSCLC細(xì)胞中的mTOR信號(hào)途徑68
• 4.3.2 蟲(chóng)草素可誘導(dǎo)人類NSCLC細(xì)胞發(fā)生自噬68-69
• 4.3.3 蟲(chóng)草素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可促進(jìn)細(xì)胞凋亡69-72
• 4.4 本章小結(jié)與討論72-74
• 第五章 總結(jié)與展望74-76
• 5.1 本文總結(jié)74-75
• 5.2 前景展望75-76
• 附錄76-77
• 參考文獻(xiàn)77-87
• 致謝87-88
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文和參加科研情況88-89
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表89

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1 毛寧;張麗艷;張鳳梅;陳秀娟;;離子交換樹(shù)脂分離純化蟲(chóng)草素的工藝條件研究[J];藥物生物技術(shù);2010年05期

2 史玉俊;;8—溴—蟲(chóng)草素具有抑制腫瘤活性[J];國(guó)外醫(yī)藥(植物藥分冊(cè));1989年01期

3 楊杰;陳順志;;蟲(chóng)草素研究進(jìn)展[J];中國(guó)生化藥物雜志;2008年06期

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本文編號(hào)：1009284