本文關(guān)鍵詞：大黃素抑制肝癌細(xì)胞侵襲及誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 大黃素 肝癌 遷移與侵襲 增殖與凋亡 體內(nèi)與體外

【摘要】：背景:肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一種發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤,由于其癥狀隱匿,大多數(shù)患者確診時已失去根治性手術(shù)的機(jī)會,而經(jīng)肝動脈導(dǎo)管介入治療及化療等治療方式的效果尚未令人滿意,因此,從中醫(yī)藥的寶庫里發(fā)掘具有有效抗肝癌的藥物是當(dāng)前研究的熱點。大黃素(Emodin)是從中藥大黃里提取的一種有效藥物,臨床研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有抑制肺癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌等多種腫瘤的作用,其機(jī)制與通過多種信號通路抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)其凋亡有關(guān),同時還能抗腫瘤血管的生成。因此,大黃素抗腫瘤效應(yīng)具有廣譜性、多靶點的特征。據(jù)文獻(xiàn)報道,大黃素具有抑制肝癌增殖及抗肝癌轉(zhuǎn)移的作用,但是,其作用的具體機(jī)制及兩者之間的關(guān)系尚缺乏實驗依據(jù)。本課題組長期從事中醫(yī)藥抗肝癌的效應(yīng)及機(jī)制研究,具備較好的實驗技術(shù)基礎(chǔ)并積累了較豐富的經(jīng)驗,在前期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)低劑量的大黃素具有抗肝癌轉(zhuǎn)移的效應(yīng),而高劑量的大黃素則具有明顯的誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用,因此,本課題主要從不同濃度的大黃素對肝癌增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響及其作用的分子機(jī)制進(jìn)行深入探討,為大黃素在臨床抗肝癌的應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)支撐。研究目的:1.體外觀察大黃素對人肝癌細(xì)胞系MHCC-97H遷移、侵襲的影響及其作用的分子機(jī)制。2.體外觀察大黃素對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖、凋亡的影響及其作用的分子機(jī)制,并在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行驗證。研究方法:1.運用MTT、CCK8方法探索不同劑量的大黃素對MHCC-97H及SMMC-7721肝癌細(xì)胞系增殖的影響。2.運用流式細(xì)胞術(shù)測定不同劑量的大黃素對MHCC-97H及SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響。3.從上述實驗結(jié)果中篩選出合適的Emodin濃度,以具有高侵襲遷移特性的MHCC-97H肝癌細(xì)胞系為主要模型,應(yīng)用Transwell小室遷移實驗檢測大黃素是否具有抑制MHCC-97H細(xì)胞遷移的效應(yīng);另外,應(yīng)用預(yù)制Matrige膠的Transwell小室模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),探索大黃素抑制MHCC-97H細(xì)胞侵襲的效應(yīng)。4.通過Western Blot技術(shù)檢測大黃素作用后肝癌細(xì)胞MAPK、AKT等信號通路的p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK、JNK、p-P38、P38、p-AKT、AKT等關(guān)鍵蛋白分子的變化,同時測定與細(xì)胞侵襲遷移密切相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9以及細(xì)胞凋亡相關(guān)分子cleaved caspase-3,9及pro-caspase-3,9等的變化,探究大黃素抑制肝癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及誘導(dǎo)其凋亡的相關(guān)信號通路及具體作用的分子機(jī)制。5.將SMMC-7721細(xì)胞種植至裸鼠右下肢皮下,建立裸鼠肝癌皮下瘤模型,通過腹腔注射不同濃度的大黃素溶液,觀察大黃素肝癌裸鼠皮下瘤生長的抑制情況,并將腫瘤標(biāo)本通過HE染色、免疫組織化學(xué)檢測PCNA、Ki-67的表達(dá)及TUNEL等探索大黃素誘導(dǎo)體內(nèi)肝癌細(xì)胞凋亡的效應(yīng),最后通過檢測裸鼠血液標(biāo)本的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、肌酐、尿素氮等指標(biāo)研究Emodin對裸鼠肝腎功能的影響以明確其安全性。結(jié)果:1.MTT實驗表明大黃素具有抑制MHCC-97H細(xì)胞增殖的作用,且呈時間及劑量依賴性,但在大黃素濃度小于50μmol/L且刺激時間小于24 h時其作用效果較弱。2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示大黃素能劑量依賴性地誘導(dǎo)MHCC-97H細(xì)胞凋亡,但當(dāng)大黃素劑量小于50μmol/L時其作用較小。3.Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)在大黃素小于50μmol/L的條件下能有效抑制MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲。4.50μmol/L的大黃素能有效抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá),且呈時間依賴性,同時能抑制p-ERK1/2、p-AKT的表達(dá)但刺激p-P38的上調(diào),而總的ERK1/2、AKT、P38表達(dá)沒有明顯變化。因此推斷大黃素抑制MHCC-97H細(xì)胞的遷移和侵襲與抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān),且可能是通過調(diào)節(jié)MAPK及AKT信號通路實現(xiàn)的。5.CCK8實驗表明大黃素能劑量、時間依賴性地抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖。而細(xì)胞流式術(shù)則表明其能劑量依賴性地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。6.100μmol/L的大黃素能有效抑制p-AKT及輕微抑制p-JNK蛋白的表達(dá),但同時激活了p-ERK1/2、p-P38蛋白而對總的AKT、JNK、ERK1/2、P38無明顯作用。同時能有效促進(jìn)cleaved caspase-3,9并輕微抑制pro-caspase-3,9的表達(dá)。7.體內(nèi)實驗結(jié)果顯示大黃素能有效抑制裸鼠肝癌的生長而不影響裸鼠的體重,HE染色結(jié)果表明大黃素能促進(jìn)腫瘤組織凋亡壞死,而免疫組化結(jié)果顯示大黃素能有效抑制Ki-67、PCNA的表達(dá)并升高TUNEL細(xì)胞染色的陽性率,驗證了大黃素在體內(nèi)亦具有抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡的效應(yīng)。8.通過肝腎功能指標(biāo)的檢測,我們發(fā)現(xiàn)大黃素沒有損害荷瘤裸鼠的肝功能及腎功能,提示大黃素抗肝癌無明顯毒副作用。結(jié)論:1.大黃素在低劑量作用下能有效抑制肝癌細(xì)胞MHCC-97H的遷移及侵襲,其分子機(jī)制與調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9的表達(dá)及MAPK、AKT信號通路相關(guān)。2.大黃素在高劑量時能有效誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的凋亡,其機(jī)制可能與激活MAPK并抑制AKT信號通路有關(guān)。該結(jié)果得到體內(nèi)研究的證實,且該藥未見明顯毒副作用。
【關(guān)鍵詞】：大黃素 肝癌 遷移與侵襲 增殖與凋亡 體內(nèi)與體外
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-10
• 縮略詞表10-11
• 前言11-13
• 第一部分 大黃素抑制肝癌細(xì)胞MHCC-97H遷移與侵襲的效應(yīng)及機(jī)制研究13-29
• 一、實驗材料、試劑和儀器13-16
• 二、實驗方法16-21
• 三、實驗結(jié)果21-26
• 四、討論26-29
• 第二部分 大黃素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞SMMC-7721 凋亡的體內(nèi)外效應(yīng)及分子機(jī)制的研究29-46
• 一、實驗材料、試劑和儀器29-30
• 二、實驗方法30-34
• 三、實驗結(jié)果34-43
• 四、討論43-46
• 全文小結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-52
• 文獻(xiàn)綜述 大黃素抗腫瘤作用研究進(jìn)展52-61
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明61-62
• 致謝62

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本文編號：1002211