發(fā)布時間：2017-10-09 17:06

  本文關(guān)鍵詞：LukS-PV通過miR-125a-3p調(diào)控白血病細胞凋亡的機制研究

  更多相關(guān)文章： PV-殺白細胞毒素 白血病細胞 凋亡 miR-125a-3p 細菌毒素

【摘要】：目的：LukS-PV是由金黃色葡萄球菌分泌的PV-殺白細胞素(PVL)雙組分之一,本課題組經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)重組LukS-PV在體內(nèi)外具有促進急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia,AML)細胞株HL-60凋亡和分化的作用,并且能夠在體外促進AML細胞株THP-1的分化。本實驗進一步研究LukS-PV對人單核細胞白血病細胞THP-1是否有促凋亡作用以及對AML病人細胞是否有抗白血病作用,并探討其作用機制,為尋求白血病新的靶向治療藥物奠定基礎(chǔ)。方法：(1)體外培養(yǎng)THP-1細胞至對數(shù)生長期,分別加入0.25,0.50,1.00μMLukS-PV作用THP-1細胞,24h后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。(2)收集培養(yǎng)AML病人的原代細胞,加入1.00 μM LukS-PV,24h后流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。(3)使用1.00 μM LukS-PV刺激不同來源的AML病人的原代細胞和THP-1細胞,24h后實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-125a-3p的表達量。(4)構(gòu)建miR-125a-3p過表達和抑制表達慢病毒載體并轉(zhuǎn)染THP-1細胞,使用1.00 μM LukS-PV刺激轉(zhuǎn)染后的THP-1細胞,24h后Western blotting檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白。(5)采用生物信息學(xué)預(yù)測技術(shù)對miR-125a-3p的靶基因進行預(yù)測,篩選凋亡相關(guān)基因,使用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸Y選的靶基因進行驗證。結(jié)果：(1) LukS-PV促進THP-1細胞的凋亡,并且凋亡作用呈劑量依賴性。(2)LukS-PV能夠促進AML病人的原代細胞的凋亡。(3)經(jīng)過LukS-PV刺激之后,THP-1細胞和AML病人的原代細胞中miR-125a-3p的表達量顯著升高。(4)miR-125a-3p的過表達可以促進THP-1細胞的凋亡。(5) miR-125a-3p的低表達可以減少LukS-PV引起的THP-1細胞的凋亡。(6)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實Bcl-2是miR-125a-3p的直接靶基因。結(jié)論：(1) LukS-PV可以促進THP-1細胞的凋亡并呈劑量依賴性。(2) LukS-PV可以促進急性髓系白血病原代細胞的凋亡。(3)LukS-PV可能通過miR-125a-3p/Bcl-2通路調(diào)控急性髓系白血病細胞的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：PV-殺白細胞毒素 白血病細胞 凋亡 miR-125a-3p 細菌毒素
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R733.7
【目錄】：

• 中英文縮略詞表6-7
• 中文摘要7-9
• ABSTRACT9-11
• 1 前言11-13
• 2 材料和方法13-22
• 2.1 實驗材料13-16
• 2.1.1 實驗儀器13-14
• 2.1.2 主要試劑14-15
• 2.1.3 主要試劑配置15-16
• 2.2 臨床材料16
• 2.3 實驗方法16-22
• 2.3.1 THP-1細胞的培養(yǎng)16
• 2.3.2 AML病人原代細胞的分離和培養(yǎng)16-17
• 2.3.3 LukS-PV蛋白表達和純化17-18
• 2.3.4 Bradford蛋白濃度測定18
• 2.3.5 Annexi nV/PI熒光雙染—流式細胞儀檢測細胞凋亡18
• 2.3.6 RNA的提取,miR-125a-3p的逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR18-19
• 2.3.7 慢病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染19-20
• 2.3.8 caspase3活性檢測20
• 2.3.9 Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白20-21
• 2.3.10 miR-125a-3p靶基因預(yù)測和驗證(雙熒光素酶報告基因)21-22
• 2.4 統(tǒng)計學(xué)處理22
• 3 結(jié)果22-34
• 3.1 LukS-PV促進THP-1細胞凋亡的檢測22-23
• 3.2 LukS-PV促進AML原代細胞凋亡的檢測23-26
• 3.3 LukS-PV刺激AML細胞株和AML原代細胞后miR-125a-3p表達量的檢測26-28
• 3.4 miR-125a-3p的過表達可以促進THP-1細胞的凋亡28-30
• 3.5 miR-125a-3p的低表達可以減少LukS-PV引起的THP-1細胞的凋亡30-31
• 3.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實Bcl-2是miR-125a-3p的直接靶基因31-34
• 4 討論34-39
• 5 結(jié)論39-40
• 參考文獻40-44
• 附錄44-45
• 致謝45-46
• 綜述46-54
• 參考文獻51-54

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本文編號：1001367