本文關鍵詞：肩部電針與康復訓練治療肩撞擊綜合征的療效比較，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

《第二軍醫(yī)大學》 2012年

siRNA雙靶向干擾IL-1β/TNF-α治療肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的實驗研究

眭杰  

【摘要】：肩袖疾�。╮otator cuff disease, RCD）是引起肩周疼痛、肩關節(jié)功能障礙的最常見原因。隨著細胞生物學和分子生物學的發(fā)展，我們對于肩袖疾病形成機理及有了更深入的認識。逐漸認識到：肩峰下滑囊炎（subacromial bursitis）是導致肩袖疾病患者肩痛及功能障礙的重要原因。肩峰下滑囊細胞是肩峰下滑囊炎的核心細胞，非特異性刺激（機械牽拉、缺氧、炎性細胞及臨近肩袖腱細胞）可通過囊壁上的壓力或化學感受器刺激其分泌IL-1、TNF-α，MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2、SDF-1、P物質(zhì)及VEGF多種炎性因子形成了一個調(diào)控慢性炎癥反應的網(wǎng)絡，而IL-1β及TNF-α是這個炎性網(wǎng)絡的關鍵因子。遺憾的是，盡管大理的研究都證實了這些細胞因子對肩峰下滑囊炎的起病與發(fā)展起到了十分重要的作用，但大都僅局限在機制的探討上，尚未有應用這些因子治療肩袖疾病患者肩峰下滑囊炎的相關報道。 小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是含有21～23bp的雙鏈RNA,可以序列特異性地切割靶RNA,介導轉錄后基因沉默，抑制蛋白質(zhì)的合成，而不誘導非特異性的雙鏈RNA反應。近年來，RNAi作為一種高效的序列特異性基因剔除技術在基因治療領域發(fā)展極為迅速。到目前為止，國內(nèi)外尚未有應用RNAi技術肩袖疾病的相關報道。本實驗中，我們利用siRNA雙靶向干擾肩峰下滑囊細胞的IL-1β及TNF-α基因，評價IL-1β及TNF-α基因剔降效果及對這個炎性網(wǎng)絡中其它炎性因子的影響。 目的 旨在明確肩峰下滑囊細胞類型及病理特征；探討利用RNAi手段沉默人肩峰下滑囊細胞IL-1β及TNF-α基因的可行性；評價IL-1β及TNF-α基因剔降效果及對這個炎性網(wǎng)絡中其它炎性因子的影響；進一步揭示肩袖疾病肩峰下滑囊炎發(fā)病機制及IL-1β及TNF-α在其炎性環(huán)路中的作用；為肩袖疾病臨床治療、未來基因治療及藥物篩選提供重要理論依據(jù)。 方法 1.取肩袖疾病患者肩峰下滑囊標本，，通過平面培養(yǎng)的方法，采用改良雙酶消化法分離、體外培養(yǎng)、純化肩峰下滑囊細胞，觀察細胞形態(tài)，通過H-E染色、Vimentin及CD68免疫熒光染色鑒定明確細胞類型。 2.設計合成針對人IL-1β基因序列特征設計特異siRNA-(1-3)，及針對人TNF-α基因序列特征設計特異siRNA-(a-c)，以陽離子脂質(zhì)體為載體，轉染體外培養(yǎng)的肩峰下滑囊細胞；FAM熒光標記，測定轉染率，觀察轉染后細胞形態(tài)。Westen blot篩選出針對IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，進一步通過Realtime-PCR檢測siRNA抑制肩峰下滑囊細胞IL-1β及TNF-α基因表達效果及劑量、時間相關性。 3.利用篩選出的針對IL-1β及TNF-α基因的有效siRNA序列，雙靶向干擾肩峰下滑囊細胞，Realtime-PCR檢測IL-1β、TNF-α、MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1等細胞因子表達水平，以不加siRNA的滑囊細胞做空白對照，評價IL-1β及TNF-α基因剔降后對這個炎性網(wǎng)絡中其它炎性因子的影響。 結果 1.人肩峰下滑囊原代細胞貼壁良好。傳至第3代后以長梭形細胞均勻生長。HE染色，普通光鏡下，細胞呈梭型，核呈圓形，較大，核仁明顯，免疫熒光結果顯示Vimentin陽性，CD68陰性，符合成纖維樣滑膜細胞特征。 2. FAM熒光標記后測定轉染率都在80％以上，觀察轉染后細胞形態(tài)及生長均無明顯影響；Westen blot結果顯示IL-1β-siRNA-2及TNF-α-siRNA-c相對基因抑制水平最強；Realtime-PCR檢測顯示siRNA抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細胞IL-1β及TNF-α基因表達時存在相似的劑量、時間相關性，隨siRNA終濃度增加，抑制效率增強；轉染后24h抑制最強，48h后逐漸減弱。 3. siRNA-2、siRNA-c均以終濃度200nmol／L同時轉染肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細胞，以不加siRNA的滑囊細胞做空白對照，Realtime-PCR結果顯示：轉染后IL-1β及TNF-α的表達被明顯抑制。MMP-1、MMP-9、COX-1的抑制效果同對照組相比有顯著差異， COX-2、SDF-1的抑制效雖不顯著，但仍有抑制。 結論 1.采用改良雙酶消化法可成功擴增并獲得相當數(shù)量的肩峰下滑囊細胞。 2.經(jīng)鑒定，肩峰下滑囊細胞培養(yǎng)至第3代為純度較高的成纖維樣滑膜細胞。 3.化學合成的IL-1β、TNF-α特異siRNA通過脂質(zhì)體瞬時轉染可以有效抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細胞IL-1β、TNF-α基因的表達。 4. siRNA抑制肩峰下滑囊成纖維樣滑膜細胞IL-1β及TNF-α基因均存在良好的劑量、時間相關性。 5.利用siRNA雙靶向干擾技術可成功剔降IL-1β、TNF-α基因的表達，并同時下調(diào)了炎性網(wǎng)絡中炎性因子MMP-1、MMP-9、COX-1、COX-2及SDF-1的表達。對炎性網(wǎng)絡有明確的抑制作用。 6.從另一面證實了在肩峰下滑囊炎炎性網(wǎng)絡中，IL-1β、TNF-α作為關鍵因子與其它炎性因子存在正反饋關系。 7.應用RNAi技術對肩峰下滑囊炎慢性炎癥反應環(huán)路中的多個靶點進行調(diào)控可能是未來治療肩峰下滑囊炎乃至肩袖疾病的有效途徑。

【關鍵詞】：
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R686
【目錄】：

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【引證文獻】

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