發(fā)布時間：2020-09-07 11:29

　　 仙茅多糖具有較好的增強免疫、抗氧化、抗疲勞等生物活性,具有很高的藥用價值和經(jīng)濟價值。本實驗探討了酶法提取仙茅粗多糖的分離純化工藝,得到了純多糖XMPS-1,測定了XMPS-1的純度和分子量。分別運用葡聚糖酶和β-半乳糖苷酶對XMPS-1進行分子修飾,考察了XMPS-1的兩種酶解工藝,并使用凝膠層析柱對酶解產(chǎn)物進行分離、薄層色譜法對酶解產(chǎn)物進行分析,通過體外細胞實驗對葡聚糖酶酶解產(chǎn)物進行了活性研究,為尋找仙茅多糖激活巨噬細胞的功能活性中心片段奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:1、在單因素考察的基礎(chǔ)上,采用Design-expert 8.0.5b軟件和響應(yīng)面法對纖維素酶提取仙茅多糖的工藝進行優(yōu)化,得到最優(yōu)的工藝條件為:酶添加量1.3%、酶解溫度58℃、酶解時間110 min和pH 5.7時,仙茅多糖提取率達到最大值,為20.52%,分別比超聲提取法和熱水浸提法所得粗多糖增多了129.8%和54.9%。通過DEAE纖維素柱和Sephadex G-50凝膠柱對粗多糖進行分離純化得到純級分XMPS-1,凝膠柱層析檢測結(jié)果和高效凝膠色譜法結(jié)果都顯示XMPS-1具有較高的純度,所以可認為XMPS-1是分子量分布均一多糖。經(jīng)高效凝膠色譜法檢測,XMPS-1相對分子質(zhì)量為3031 Da。2、考察了酶添加量、溫度、時間和pH對XMPS-1葡聚糖酶酶解產(chǎn)物的影響,在單因素基礎(chǔ)上,使用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝。模型P0.0001,失擬項P=0.34330.05,表明模型擬合程度較好,方法具有設(shè)計意義。最佳酶解條件為:酶添加量56%,溫度52℃,酶解時間12 h,pH 6.0,此時還原糖生成量可達0.2019mg/mL,經(jīng)實驗驗證,所測值與期望值差值在5%以內(nèi),較吻合,可信度較高。對酶解產(chǎn)物通過Sephadex G-25凝膠柱分離、薄層分析,酶解時間為7~9 h的3批酶解產(chǎn)物顯示有較純酶解產(chǎn)物片段生成。3、以還原糖的生成量為檢測指標,運用響應(yīng)面-星點設(shè)計法構(gòu)建了有關(guān)β-半乳糖苷酶的各酶解因素對XMPS-1酶解工藝影響的模型。酶添加量、酶解時間的適當增加以及適宜的pH值和溫度都能增加還原糖的生成,各因素對還原糖生成量的影響強弱為:時間酶添加量溫度pH值;最佳優(yōu)化條件為酶添加量10000 U/g,溫度46℃,酶解時間10 h,pH 6.6。通過Sephadex G-25凝膠柱分離、薄層分析,酶解2.5,5.0,7.5和10.0 h的4批酶解產(chǎn)物經(jīng)透析后分別得到了較純的酶解產(chǎn)物片段。4、將葡聚糖酶酶解XMPS-1得到的12批酶解產(chǎn)物進行活性分析,經(jīng)過MTT實驗發(fā)現(xiàn),樣品濃度500μg/mL以下,孵育時間48 h以內(nèi),藥品對細胞沒有明顯的毒害作用;且多數(shù)樣品的細胞存活率高于100%,說明多數(shù)XMPS-1的酶解產(chǎn)物不僅對細胞無毒害,還對細胞的生長具有一定的促進作用。通過ELISA測試試劑盒和Griess法檢測加入藥液后巨噬細胞分泌的TNF-α、IL-1和NO的含量,綜合各酶解產(chǎn)物對三種細胞因子的作用效果,可以得出,大多數(shù)酶解產(chǎn)物對三種細胞因子的分泌都有較好的促進作用,尤以酶解5 h的酶解產(chǎn)物最為突出,其在不同孵育時間和不同的樣品濃度下對三種細胞因子的分泌都有較好的促進作用,具有深入研究價值。
【學位單位】：貴州大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：R284.2

【參考文獻】

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本文編號：2813280