苔類植物是最早的陸生植物群,為了適應(yīng)干旱的陸地環(huán)境,體內(nèi)產(chǎn)生了豐富的次級代謝產(chǎn)物(包括聯(lián)芐、萜類、木脂素類、香豆素和黃酮類等化合物)。黃酮類化合物具有重要的生理活性,在植物應(yīng)對生物和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。該類化合物在母核形成之后可發(fā)生多種修飾反應(yīng)包括甲基化、糖基化和酰基化等,因此種類繁多。黃酮是苔類植物中常見的成分,不同類別的黃酮已被分離鑒定,其中包含甲基化和糖基化的黃酮。黃酮甲基化反應(yīng)由植物氧甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferases,OMTs)參與催化,將S-腺苷-L-甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine,SAM)提供的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到黃酮羥基上。OMTs 一般分為兩類:Class Ⅰ OMTs 和 Class Ⅱ OMTs。Class Ⅰ OMTs也稱為咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeoyl CoA O-methyltransferases,CCoAOMTs),分子量一般在23-29 KDa,酶活反應(yīng)需要Mg2+的參與,特異性催化脂酰輔酶A,其亞類CCoAOMT-like可催化香豆素和黃酮等多種化合物。ClassⅡOMTs分子量較大,且不需要金屬離子參與催化,該類酶稱為咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(Caffeic　acid　O-methyltransferases,COMTs),催化底物包括咖啡酸、香豆素、生物堿和各種黃酮等化合物。本文從鈍鱗紫背苔(Plagiochasma　appendiculatu 的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫篩選出四個注釋為COMT的基因,分別命名為PaF4'OMT,PaCOMT2,PaCOMT3和PaCOMT4。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn),PaF4'OMT比來自其他植物的COMTs長約27個氨基酸。將蛋白長的N端截掉并命名為PaCOMT1-Tr。進(jìn)化分析表明,四個目的基因都屬于Class Ⅱ OMTs,位于黃酮氧甲基轉(zhuǎn)移酶的根部。從植物中克隆出目的基因全長,構(gòu)建到蛋白表達(dá)載體上,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后用Ni柱分離純化蛋白。酶活結(jié)果顯示,PaF4'OMT可以催化一系列黃酮生成B環(huán)對位羥基甲基化產(chǎn)物,而不能催化苯丙素類化合物。其最適底物是芹菜素,可被催化生成金合歡素。PaCOMT1-Tr也具有催化活性,但反應(yīng)效率和底物選擇性低于PaF4'OMT,說明在植物體內(nèi)真正起作用的是PaF4'OMT。PaCOMT2-4不具有催化活性。金合歡素是一種重要的化合物,具有多種藥用價值,通過芹菜素甲基化的方式生成金合歡素,構(gòu)建了含有PaF4'OMT的工程菌株,利用工程菌株發(fā)酵的方法獲得該化合物。這是第一次從苔類植物中鑒定出二類氧甲基轉(zhuǎn)移酶。實驗室前期從粗裂地錢(Marchantia paleacea)和鈍鱗紫背苔中克隆并鑒定了兩個氧甲基轉(zhuǎn)移酶,分別為MpOMT和PaF6OMT。序列比對和進(jìn)化樹分析結(jié)果表明它們屬于Class ⅠOMTs,但與經(jīng)典OMTs序列相似性低,在進(jìn)化關(guān)系上與動物兒茶酚氧甲基轉(zhuǎn)移酶聚為一簇。為了研究該類基因是否在苔類植物中普遍存在以及在進(jìn)化過程中的關(guān)系,用MpOMT序列搜索楔瓣地錢(Marchantia emarginata)和圓葉裸蒴苔(Haplomitrium mnioides)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫,找到兩個CCoAOMTs并分別命名為MeOMT和HmOMT。這兩個基因在進(jìn)化地位上與MpOMT和PaF60MT 一致。MeOMT、HmOMT和MpOMT具有相似的催化特性,可反應(yīng)多種底物,催化效率高,最適底物是秦皮乙素,而PaF60MT主要催化黃芩素和野黃芩素C-6位羥基的甲基化。MeOMT、HmOMT、MpOMT和PaF60MT具有很高的序列相似性,但是催化特點不同。為了研究與底物催化有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸,對MpOMT和PaF60MT進(jìn)行了點突變,發(fā)現(xiàn)PaF60MT中第59位的精氨酸有利于黃芩素和野黃芩素的C-6位羥基的甲基化。底物飼喂實驗表明基因在載體上的連接位置、底物濃度等均可影響產(chǎn)物的產(chǎn)量,并提出一種新的生產(chǎn)千層紙素A和東莨菪內(nèi)酯的方法。黃酮苷類化合物由糖基轉(zhuǎn)移酶(Uridine diphosphate glycosyltransferases,UGTs)催化生成,糖基轉(zhuǎn)移酶將UDP活化的糖基供體轉(zhuǎn)移到黃酮類化合物形成糖苷。黃酮的糖基化有利于化合物轉(zhuǎn)運和代謝。為了研究苔類植物中UGTs的催化特點和功能,本文從鈍鱗紫背苔的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出三個注釋為UGT的基因,分別命名為PaUGT1、PaUGT2和PaUGT3。經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn),PaUGTs序列與其他植物的UGTs差異較大,但C端的PSPG序列相似性高,關(guān)鍵氨基酸保守。進(jìn)化樹分析表明三個基因同屬于一簇,和其他植物黃酮7-O-GTs屬于同一進(jìn)化枝。將三個基因從鈍鱗紫背苔中克隆出來,構(gòu)建入原核表達(dá)載體,并用UDP-葡萄糖作為糖基供體進(jìn)行了體外酶活反應(yīng),結(jié)果顯示PaUGT1是黃酮7位糖基轉(zhuǎn)移酶,催化芹菜素、木樨草素、槲皮素和山奈酚四種底物生成黃酮7-O-葡萄糖苷。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R284
【部分圖文】：

０．５逡逑圖２．２邋ＰａＣＯＭＴｓ系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．２邋Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ＰａＣＯＭＴｓ．逡逑Ｔｈｅ邋ｓｃａｌｅ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ邋ｄｉｓｔａｎｃｅ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒｓ邋ｓｈｏｗｎ邋ａｒｅ邋ｂｏｏｔｓｔｒａｖａｌｕｅｓ，邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋１，０００邋ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ．邋ＩＯＭＴ，邋ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ邋Ｏ－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；邋ＤＯＭＴ

圖２．４邋ＰａＦ４＇ＯＭＴ對不同底物的相對催化活性逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２．４邋Ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｃａｔａｌｙｔｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋ＰａＦ４’ＯＭＴ邋ｔｏｗａｒｄｓ邋ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．（見實逡逑驗記錄邋０００３３８５邋Ｐ６７）逡逑

圖２．６溫度和ｐＨ對催化效率的影響逡逑Ｆｉｕｒｅ邋２．６邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｖａｒｉｎｔｈｅＨ邋ａｎｄ邋ｔｅｍｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ｅｎｚｍｅ邋ａｃｔｉｖｉｔ．（

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本文編號：2813369