【摘要】：第一章 文獻研究本章較為系統(tǒng)地對糖尿病及其慢性并發(fā)癥的研究進展進行歸納總結(jié),為深入認識糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機制提供科學根據(jù)和理論指導(dǎo)。同時還總結(jié)了丹參及丹參莖葉中主要的活性成分,分析了近年來國內(nèi)外在丹參及丹參莖葉治療糖尿病及其慢性并發(fā)癥所取得的研究進展,以期為丹參及丹參莖葉的綜合開發(fā)與利用及其在臨床上的合理用藥提供科學根據(jù)和理論指導(dǎo)。第二章 丹參莖葉有效部位制備與化學成分分析本實驗對丹參莖葉有效部位的提取純化工藝進行了系統(tǒng)研究及綜合評價。選取丹參莖葉中9種酚酸類成分、4種黃酮類成分的總含量及其浸膏得率為評價指標,通過單因素實驗確定丹參莖葉提取方法及正交試驗的因素水平,后采用正交試驗考察提取溶劑、提取時間、料液比及提取次數(shù)對丹參莖葉提取工藝的影響,篩選其最佳提取工藝。采用大孔吸附樹脂對丹參莖葉粗提物進行純化,進一步考察樹脂類型、上樣液質(zhì)量濃度、上樣量、洗脫劑濃度及洗脫劑用量對指標成分純化的影響,確定最佳大孔吸附樹脂純化工藝。并采用乙酸乙酯萃取法進一步提高指標成分的純度。實驗最終確定的最佳制備工藝為:以50%乙醇8倍量回流提取3次,每次提取1.0 h,合并多次提取液,濃縮后揮干溶劑即得丹參莖葉粗提物;以AB-8型大孔吸附樹脂純化,1.0 g/mL藥液上樣,上樣量為每10 g干樹脂上樣5 g生藥即1.5 g干燥提取物,40%乙醇洗脫,洗脫用量3 BV,可得丹參莖葉大孔樹脂純化物;采用乙酸乙酯萃取對其進一步純化富集,萃取工藝為:萃取底物濃度0.1 g/mL、底物pH值為2、以2倍體積的乙酸乙酯萃取3次,合并多次乙酸乙酯部位萃取液,揮干溶劑后即得丹參莖葉總酚酸。該提取及純化工藝穩(wěn)定可行,純化后丹參莖葉總酚酸純度可達71.92%。第三章 丹參莖葉改善糖尿病腎病的多組分優(yōu)化與作用機制研究一、基于HK-2、HBZY-1細胞模型篩選丹參莖葉多組分配伍比例本節(jié)實驗以高糖及過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜HBZY-1細胞及人腎小管上皮HK-2細胞損傷,建立體外腎組織細胞氧化應(yīng)激模型,并從細胞增殖、細胞形態(tài)變化等方面研究丹參莖葉多組分對HK-2、HBZY-1細胞損傷的保護作用,篩選丹參莖葉中多種酚酸類成分的最佳配伍比例,為后續(xù)體內(nèi)活性實驗提供數(shù)據(jù)支撐。研究結(jié)果表明,丹參莖葉多組分中酚酸類成分(丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸)對HK-2及HBZY-1細胞的氧化損傷均有顯著性的保護作用,丹參素未呈現(xiàn)出保護氧化損傷的活性;黃酮類成分中,蘆丁對H2O2誘導(dǎo)HBZY-1損傷有一定的保護作用,異槲皮苷對H2O2誘導(dǎo)HK-2損傷有一定的保護作用,但對高糖模型均無回調(diào)趨勢,紫云英苷未呈現(xiàn)出保護活性;丹參酮類成分也均未呈現(xiàn)出保護活性。后續(xù)單體配伍比例篩選實驗中,選擇5種單體成分即丹酚酸B、迷迭香酸、紫草酸、丹參素、丹參酮IIA按照其在根中的比例(摩爾質(zhì)量比1:0.07:0.04:0.07:0.05)、莖葉中的比例(摩爾質(zhì)量比1:1.16:0.02:0.11:0.05)、自選比例(摩爾質(zhì)量比1:1:1:1:1)進行組合,并考察加減丹參素、加減丹參酮IIA對單體配伍后活性的影響。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),5種不同單體成分以不同比例配伍后對其細胞活性影響較大,其中5種單體成分按照根中存在的比例配伍(VG)、3種單體成分按照莖葉中存在比例配伍(TJ)、3種單體成分按照自選比例配伍(TZ)、4種單體成分按照莖葉中比例配伍(FJ)在HBZY-1、HK-2細胞的高糖及過氧化氫損傷模型中均顯示出較好的活性,該結(jié)果可為后期體內(nèi)藥效活性篩選實驗提供數(shù)據(jù)支撐。二、基于db/db小鼠模型的多組分改善糖尿病腎病的生物效應(yīng)評價本節(jié)以db/db 2型自發(fā)性糖尿病腎病小鼠為實驗動物模型,給予丹參莖葉多組分不同比例配伍后藥物干預(yù),對其腎臟病理切片及各項生化指標進行綜合分析。實驗結(jié)果表明,丹參莖葉多組分配伍后多組藥物可對糖尿病腎病小鼠的病理狀態(tài)有不同程度的改善作用,部分給藥組可顯著性回調(diào)其體內(nèi)生化指標的病理性改變。綜合各組生化指標改善情況及病理切片結(jié)果,同時參考前期細胞水平的活性篩選結(jié)果,初步確定5種單體成分最優(yōu)配伍比例為:3種單體成分按照莖葉中存在比例配伍(TJ)、5種單體成分按照根中存在的比例配伍(VG)。兩組配伍比例的高劑量組均能顯著地改善糖尿病所引起的各項指標,調(diào)節(jié)其血糖水平、血脂水平及腎臟損傷,且其回調(diào)水平均優(yōu)于其低劑量組。同時TJ、VG組可顯著改善高糖及過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細胞HBZY-1及人腎小管上皮細胞HK-2損傷,表明其在體內(nèi)、體外水平上均呈現(xiàn)良好的活性。三、丹參莖葉多組分對db/db小鼠腸道菌群多樣性的調(diào)節(jié)作用研究本節(jié)實驗通過16Sr DNA技術(shù),分析db/db糖尿病腎病小鼠糞便及盲腸內(nèi)容物中腸道菌群多樣性,研究丹參莖葉多組分藥物對糖尿病腎病小鼠腸道菌多樣性的干預(yù)作用。本節(jié)實驗結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組小鼠腸道菌群在門、屬水平上均有顯著性差異。模型組中 Lachnoclostridium、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Eubacterium_nodatum_group、Firmicutes、Christensenellaceae、Lachnospiraceae_UCG-001、Coriobacteriaceae、Bacteroidales_S24-7_group、Lactobacillus、Ruminococcaceae_UCG-013、Eubacterium_coprostanoligenes group均發(fā)生了顯著性變化。表明糖尿病腎病小鼠體內(nèi)發(fā)生了一定程度的腸道菌群失調(diào),同時丹參莖葉多組分能回調(diào)其腸道菌群的失衡,其中3種單體成分按照莖葉中存在比例配伍(TJ)、5種單體成分按照根中存在的比例配伍(VG)的高劑量組均表現(xiàn)出良好的回調(diào)效果,該結(jié)果可進一步證明TJ、VG可能為單體配伍的最佳比例。四、基于TGF-β/Smad信號通路的多組分改善糖尿病腎病作用機制研究本節(jié)實驗以高糖誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞(HK-2)體外氧化應(yīng)激為模型,采用丹參莖葉多組分進行干預(yù),ELISA法測定細胞上清液中細胞因子的表達、Western blotting及Real-time PCR檢測各細胞中相關(guān)蛋白及其mRNA的表達量;同時以Western blotting法檢測小鼠腎臟組織中相關(guān)蛋白的含量。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),丹參莖葉多組分可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、TGF-β/Smad信號通路中相關(guān)蛋白的含量、回調(diào)其mRNA的表達水平,從而改善高糖條件下所導(dǎo)致的HK-2細胞凋亡并改善糖尿病小鼠腎組織的損傷。第四章 丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病的代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學及蛋白質(zhì)組學研究一、丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病的代謝組學研究本節(jié)實驗采用代謝組學的分析手段,對糖尿病腎病小鼠的血清以及尿液樣本進行內(nèi)源性代謝物質(zhì)檢測,從體內(nèi)代謝小分子物質(zhì)的角度闡述丹參莖葉多組分對糖尿病腎病的改善作用。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),糖尿病小鼠血清中可鑒定出14個潛在代謝物;尿液中可鑒定出68個潛在代謝物,給予丹參莖葉多組分后可不同程度地回調(diào)小鼠體內(nèi)代謝紊亂。血清樣本中內(nèi)源性代謝物主要參與了醚脂類代謝、生物素代謝、類固醇激素生物合成、鞘脂代謝;尿液樣本中內(nèi)源性代謝物主要參與了泛醌和其他萜類醌生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酰胺代謝。血清與尿液樣本中的潛在代謝物可共同調(diào)節(jié)甾類激素生物合成以及鞘脂類代謝。二、丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病的轉(zhuǎn)錄組學研究結(jié)合前期體外細胞活性實驗以及體內(nèi)藥效作用評價篩選的結(jié)果,本節(jié)實驗選取5組實驗樣本即空白組、模型組、陽性藥(二甲雙胍)組、3單體以莖葉比例配伍高劑量組(TJH)、5單體以根比例配伍高劑量組(VGH)小鼠的腎臟樣本,進行轉(zhuǎn)錄組學實驗,從轉(zhuǎn)錄本的層面闡明丹參莖葉多組分對糖尿病腎病的改善作用,探討其分子機制。結(jié)合加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)(WGCNA)分析實驗結(jié)果并經(jīng)過基因數(shù)據(jù)庫篩選后,本實驗確定了 11個候選基因,分別為 Egr1、Foxo3、Pik3r3、Fgfl、Sost、Wnt1Oa、Tgif2、Akt2、Mep1b、Collal、Apoe,1 1個候選基因可涉及多條信號通路。三、丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病的蛋白質(zhì)組學研究本節(jié)實驗采用蛋白質(zhì)組學的研究手段,對五組實驗樣本即空白組、模型組、陽性藥(二甲雙胍)組、3單體以莖葉比例配伍高劑量組(TJH)、5單體以根比例配伍高劑量組(VGH)小鼠的腎臟樣本進行高通量蛋白質(zhì)組測定,從蛋白的層面闡述丹參莖葉多組分對糖尿病腎病的改善作用。實驗結(jié)果表明,空白組與模型組比較后可篩選出539個顯著性差異蛋白。對差異蛋白進行生物信息學分析(GO富集、KEGG富集、PPI分析)后,發(fā)現(xiàn)其主要涉及氧化磷酸化、脂肪酸降解等多種生物過程。同時結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組學中的差異表達基因以及WGCNA分析結(jié)果,確定了7個候選差異蛋白,即P61148、Q80XU3、Q91W43、Q61847、P19324、P24472、P52480。四、丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病的多組學聯(lián)合分析及機制探討本節(jié)實驗對前期代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學以及蛋白質(zhì)組學的數(shù)據(jù)進行聯(lián)合分析處理,探索丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病可能的作用機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),有12個基因在蛋白組與轉(zhuǎn)錄組中共同上調(diào),163個基因只在蛋白組中上調(diào),20個基因只在基因組中上調(diào);49個基因在蛋白組與轉(zhuǎn)錄組中共同下調(diào),310個基因只在蛋白組中下調(diào),16個基因只在基因組中下調(diào)。將代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學兩兩聯(lián)合比較時,發(fā)現(xiàn)其主要涉及的生物途徑包括類固醇代謝過程、脂質(zhì)代謝、細胞對葡萄糖刺激反應(yīng)、類固醇結(jié)合、亞油酸代謝、花生四烯酸代謝。三者聯(lián)合分析時,其主要涉及的生物途徑包括花生四烯酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運、癌癥中的膽堿代謝,且前期實驗結(jié)果中可見丹參莖葉能改善與該通路相關(guān)的基因及內(nèi)源性小分子代謝物。五、丹參莖葉多組分改善糖尿病腎病分子機制驗證本章采用熒光定量PCR對前期轉(zhuǎn)錄組學中篩選出的候選基因進一步驗證,并推測其可能的分子機制。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),空白組與模型組比較,除Akt2基因,其余候選基因差異倍數(shù)均較顯著;Foxo3、Pik3r3、Fgfl、WntlOa、Mep1b基因P-Value有顯著性。經(jīng)藥物調(diào)節(jié)后,模型小鼠體內(nèi)的差異候選基因發(fā)生不同程度的改變,且二甲雙胍和丹參莖葉多組分藥物可能通過調(diào)節(jié)不同的分子途徑,從而改善糖尿病腎病。二甲雙胍組可顯著性改變Foxo3、Fgfl、Sost、Akt2、Mep1b基因;三單體莖葉比例組、五單體根比例組可顯著性調(diào)節(jié)Egr1、Pik3r3、Collal基因,其調(diào)節(jié)基因為PI3K/Akt/FoxO信號通路中的關(guān)鍵基因。
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

第二章丹參莖葉有效部位制備與化學成分分析條件逡逑ｓＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣＢＥＨＣｉ８（２．１邋ｍｍｘｌＯＯｍｍ，１．７邋ｐｍ）色譜柱；柱溫：（Ａ）－Ｏ．ｌ％甲酸水溶液（Ｂ），梯度洗脫（０￣ｌｍｉｎ，５％？５％Ａ；邋ｌ￣３３？７ｍｉｎ，１０％？１５％Ａ；邋７￣ｌｌｍｉｎ，１５％？２１％Ａ；邋ｌｌ￣１５ｍｉｎ，邋２７ｍｉｎ，３３％？７０％Ａ；邋１７￣１８ｍｉｎ，７０％邋？８０％Ａ；邋１８邋？２０ｍｉｎ，邋８０，８０邋％邋￣邋５邋％）；流速：０．４邋ｍＬ．ｍｉｎ－１；進樣量：２邋ｎＬ；檢測波長：２８０）和２５４邋ｎｍ邋（黃酮類成分）�；旌蠈φ杖芤杭暗⑶o葉樣品色譜圖（２３

提取ｌｈ；醇提后藥渣以料液比為１：邋８，水煎煮提�。贝危崛。欤�，合并兩次提取逡逑液，測定指標成分含量。實驗結(jié)果表明，乙醇回流法對指標成分的提取率最高，故選擇乙逡逑醇回流法對丹參莖葉藥材進行提取，并進行單因素及正交試驗考察優(yōu)化提取工藝。見圖２－２。逡逑５邋崖％「邐邐逡逑４．５００％邐■邐．逡逑ａ逡逑＜＾邋４．０００％邋？逡逑＇．５。。％邐．邐媻．：‘逡逑３．０００％邐邐＾邐逡逑超聲邐乙醇回流邐乙醇＋水煎煮逡逑提取方法逡逑圖２－２提取方法對指標成分總含量的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｍｅｔｈｏｄ逡逑２．３．２提取溶劑考察逡逑精密稱取丹參莖葉藥材粉末５份，每份５ｇ，以１：邋８料液比，提取２次，每次ｌｈ，考逡逑察提取溶劑即水和不同乙醇濃度（３０％、５０％、６０％、７０％、９０％）提取對丹參莖葉中酚酸類逡逑成分及黃酮類成分含量的影響。結(jié)果表明，丹參莖葉中酚酸類及黃酮類成分含量隨乙醇濃逡逑度的升高而增長，在乙醇濃度為６０％時達到峰值，后隨乙醇濃度的升高而下降。見圖２－３。逡逑２０逡逑

精密稱取丹參莖葉藥材粉末５份，每份５邋ｇ，以６０％乙醇，提�。泊�，每次ｌｈ，考察逡逑不同料液比（１：８、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０）對提取成分總含量的影響。結(jié)果表明，當料液比逡逑為１：１５時，總含量達到峰值，不同料液比間含量無明顯差異。見圖２－４。逡逑５．５００％逡逑５．０００％邋，邐ｍｍ邋｜ｈ逡逑＿一＿邋Ｉ丨丨丨逡逑４．０００％邋￣—逡逑１：８邐１：１０邐１：１２邐１：１５邐１：２０逡逑料液比／（ｇ＾ｒｎＬ－１）逡逑圖２－４料液比對指標成分總含量的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｒａｔｉｏ邋ｏｆ邋ｍａｔｅｒｉａｌ邋ｔｏ邋ｌｉｑｕｉｄ逡逑２．３．４提取時間考察逡逑精密稱取丹參莖葉藥材粉末５份，每份５邋ｇ，以６０％乙醇，１：邋８料液比，提�。贝�，逡逑考察不同的提取時間（ｌｈ、１．５邋ｈ、２邋ｈ、２．５邋ｈ、３邋ｈ）對指標成分總含量的影響。結(jié)果表明，逡逑丹參莖葉中酚酸類及黃酮類成分含量隨時間的增加而升高，在２ｈ時達到峰值，后隨時間逡逑的增加而下降。見圖２－５。逡逑４．５００％逡逑４．３００？／0邋－逡逑ｍ邋４．１００％邋－逡逑ｓ：：：：ｌ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ邐Ｉ逡逑３．５００％邋￣—逡逑１邐１．５邐２邐２．５邐３逡逑提取時間／ｈ逡逑圖２－５提取時間對指標成分總含量的影響逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－５邋Ｅｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．５提取次數(shù)考察逡逑精密稱取丹參莖葉藥材粉末４份，每份５邋ｇ，以６０邋％乙醇，１：８料液比，提取時間為每逡逑２１逡逑

本文編號：2803006