【摘要】：目的:1、椎間盤退變和椎體骨質(zhì)疏松常相互伴隨,多見于“腎虛”的中老年人群,是引起脊柱源性疾病一系列臨床表現(xiàn)的根源,也是研究的熱點和難點。本研究旨在尋找影響椎間盤退變的致病因素,探討椎體骨質(zhì)疏松及骨代謝與其的內(nèi)在聯(lián)系,明確椎體骨質(zhì)疏松及骨代謝轉(zhuǎn)換在椎間盤退變中的作用。2、制作動物模型,觀察脊柱退變中椎體骨質(zhì)疏松、終板病變及椎間盤退變的發(fā)生情況,對其相關性進一步加以驗證;同時,基于TGFβ1-Smad2/3信號通路,觀察其是否參與椎體與椎間盤間的骨軟骨代謝調(diào)控并介導異常的組織結構重塑,探討椎體骨質(zhì)疏松與椎間盤退變相互聯(lián)系和發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制。3、在中醫(yī)理論體系辨證指導下,運用補腎中藥-腎骨安進行干預,觀察其是否能調(diào)控椎體及椎間盤TGFβ1-Smad2/3信號和微環(huán)境,影響骨軟骨代謝,改善脊柱退行性疾病中骨與關節(jié)微結構和組織病理,為臨床運用補腎中藥防治椎體骨質(zhì)疏松和椎間盤退變提供實驗基礎。方法:1、臨床研究腰椎間盤退變與椎體骨質(zhì)疏松及血清骨代謝水平的關系回顧性收集80例中老年慢性腰痛患者,通過病案管理系統(tǒng)獲取其腰椎MRI影像、骨密度(BMD)、骨代謝指標以及病案資料,閱讀病歷進行篩選、納入和排除。依據(jù)腰椎MRI影像對L1-L4椎間盤退變程度進行Pfirrmann的1-5度分級,根據(jù)L1-4椎體骨密度檢測結果對骨質(zhì)疏松程度進行1-4度分級,統(tǒng)計學分析二者嚴重程度的相關性,統(tǒng)計不同椎間盤退變程度的骨代謝水平,分析其差異性。2、動物實驗研究(1)去卵巢及應力失衡條件下椎體、椎間盤的結構和代謝改變40只12周齡SPF級C57BL/6J雌性小鼠隨機分為4組:正常對照組(CT)、去卵巢組(OVX)、失穩(wěn)組(SW)、復合模型組(OS),每組10只。每周進行稱重,觀察小鼠體重變化,造模后12周后取材,觀察子宮形態(tài)改變并稱重。對L4/5節(jié)段行Micro-CT掃描,觀察椎體骨量、微結構,終板形態(tài)和椎間盤體積改變。制作石蠟切片,HE及番紅O-固綠染色觀察椎體、終板及椎間盤組織病理形態(tài)學,免疫組化/免疫熒光檢測椎間盤中Ⅰ型膠原蛋白(Col1)、Ⅱ型膠原蛋白(Col2)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。(2)補腎中藥、阿侖膦酸鈉及TGFβ抑制劑SB505124對椎體及椎間盤結構的影響75只12周齡SPF級C57BL/6J雌性小鼠隨機分為5組:正常對照組(CT)、復合模型組(OS)、TGFβ抑制劑組(SB)、阿侖膦酸鈉組(ALN)、補腎中藥組(HB),每組15只。造模完成后,預防性給藥12周,對L4/5節(jié)段行Micro-CT掃描,分析檢測L4椎體骨量、微結構參數(shù),上下終板體積和孔隙率及L4/5椎間盤的體積。番紅O-固綠染色觀察椎間盤組織病理學改變。(3)補腎中藥對椎體和椎間盤中TGFβ/smad關鍵信號分子及骨軟骨代謝的調(diào)控作用動物實驗研究第(2)部分中小鼠L4/5節(jié)段行Micro-CT掃描后,進行石蠟切片,免疫組化方法檢測椎間盤中Col1、Col2、MMP9、CD31、TGFβ、P-Smad2/3表達。Western blot方法分別檢測椎間盤中Smad3、P-Smad2/3和VEGF的表達,以及椎體中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、Osterix的表達。結果:1、臨床研究中老年慢性腰腿痛患者中多伴有椎體骨量降低或骨質(zhì)疏松,腰椎間盤退變程度以中度至重度退變?yōu)橹?Pfirrmann 3級以上),多位于下位腰椎(L4/5節(jié)段為主)。椎間盤退變程度與椎體骨質(zhì)疏松程度具有正相關關系(r=0.459,P0.001),嚴重的腰椎骨質(zhì)疏松患者中椎間盤退變的發(fā)生率增加,退變的等級升高。同時在椎間盤平均退變水平高的患者中,其血清骨代謝指標(PINP、CTX-1)較退變程度輕的患者明顯升高,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2、動物實驗研究(1)去卵巢及應力失衡條件下椎體、椎間盤的結構和代謝改變與CT組及SW組相比,OVX可引起小鼠體重明顯增加,并出現(xiàn)子宮萎縮(P0.05)。OVX及SW均可引起椎間盤退變的發(fā)生,OS導致更為嚴重的椎間盤退變。Micro-CT結果顯示OVX可導致椎體骨質(zhì)疏松,OVX組及OS組BMDtv及BV/TV、Tb.N、Tb.Th較CT組明顯變差(P0.05)。SW可一定程度影響軟骨下骨,SW組與CT組比較各參數(shù)均無明顯差異,(P0.05),但BMDtv有上升趨勢;而OS組與OVX組比較BV/TV明顯升高(P0.05),且BMDtv、BS/TV、Tb.N有上升趨勢,Tb.Sp、SMI有下降趨勢。OVX可造成椎間盤終板的骨化重塑,SW可引起終板下骨硬化;與CT組比較,SW組及OS組椎間盤體積均明顯降低,OS組下降更為嚴重(P0.05);OVX組與CT組比較無明顯統(tǒng)計學差異(P0.05),但有下降趨勢。病理結果顯示OVX導致椎體骨小梁稀疏及終板骨化重塑,與micro-CT相符,同時,OVX組及OS組椎體及椎間盤中可見細胞明顯減少;SW可導致纖維環(huán)結構的破壞、紊亂和融合,以及軟骨下骨的應力性改變,OS促使椎間隙的塌陷融合。免疫組化/免疫熒光顯示顯示OS組、OVX組、SW組與CT組比較,Col2表達均降低,Col1無明顯差異,但OVX組及OS組稍高;OVX組及OS組椎間盤中VEGF表達較CT組及SW組明顯升高,在終板骨化重塑區(qū)尤為明顯。(2)補腎中藥,阿侖膦酸鈉及TGFβ抑制劑SB505124對椎體及椎間盤微結構和病理學的影響Micro-CT結果顯示OS組出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松和終板病變,椎體BMDtv明顯降低(P0.05),各骨微結構參數(shù)變差(P0.05),上、下終板體積和孔隙明顯增高(P0.05),同時出現(xiàn)椎間盤體積明顯降低(P0.05)。與OS組比較,SB、ALN、HB組椎體BMDtv有上升趨勢,以ALN組最為明顯,同時骨微結構參數(shù)均不同程度改善(P0.05),終板的骨化重塑一定程度上得到抑制,其體積縮小,孔隙率降低(P0.05),椎間盤體積增加(P0.05)。病理結果顯示,與CT組比較,OS組椎間盤結構形態(tài)紊亂,出現(xiàn)嚴重退變,而與OS組比較,SB組、ALN組及HB組均不同程度延緩了椎間盤退變,改善了椎間盤的組織病理形態(tài)。(3)補腎中藥對椎體和椎間盤中TGFβ/smad關鍵信號分子及骨軟骨代謝的調(diào)控作用免疫組化結果顯示,OS組椎間盤中Col1、TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、CD31較CT組均明顯升高,而Col2明顯降低。與OS組比較,SB組、ALN組和HB組椎間盤中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9、CD31較OS組均不同程度下降;SB及ALN對Col2表達無明顯影響,但Col1表達降低,而HB組中Col2及Col1表達均明顯增加。WB結果顯示OS組椎間盤Smad3、P-Smad2/3及VEGF表達較CT組明顯升高。而SB組、ALN組、HB組椎間盤中Smad3、P-Smad2/3及VEGF表達均較OS組明顯降低,其中,SB組及HB組P-Smad2/3下降明顯,說明HB可抑制TGFβ/smad信號的激活。椎體WB結果顯示OS組中TGFβ1、P-Smad2/3、MMP9較CT組均明顯升高,osterix降低;與OS組比較,SB組TGFβ1明顯升高,P-Smad2/3明顯降低,可能與通路抑制后機體代償反應有關,同時其可促使osterix的表達,而MMP9表達無明顯改變;ALN組TGFβ1、MMP9明顯降低,同時伴隨P-smad2/3表達降低,說明抑制破骨可明顯抑制TGFβ1的釋放,抑制TGFβ/smad信號的激活,其osterix表達未見明顯改變,表明ALN對成骨無明顯影響。HB組顯示TGFβ1下降,同時P-Smad2/3表達顯著降低,說明HB具有TGFβ/smad通路的抑制效應,與SB組類似,其osterix表達升高,MMP9表達無明顯改變。表明其同時具有成骨效應。結論:1、椎間盤退變與椎體骨質(zhì)疏松具有正相關關系,骨質(zhì)疏松可能促使椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展。血清中骨代謝指標水平與椎間退變具有相關性,其在一定程度上具有作為預測椎間盤退變指標的可能。2、去卵巢和應力失衡均能導致小鼠椎間盤退變的發(fā)生,二種因素復合情況下會發(fā)生更為嚴重的椎間盤退變。椎體、終板的結構病變和骨軟骨代謝異�？赡茉谧甸g盤退變中起重要作用,力學和代謝因素的惡性循環(huán)可能是導致椎間退變不斷進展的原因。同時,椎體骨質(zhì)疏松引起終板重塑后孔隙的增加及血管新生并不是為椎間盤提供充足的營養(yǎng),反而促使椎間盤退變,其可能與引起髓核內(nèi)壓緩慢丟失及擾亂椎間盤內(nèi)環(huán)境有關。3、代謝紊亂或者力學刺激導致異常的椎體、終板骨軟骨基質(zhì)轉(zhuǎn)換,釋放大量活性TGFβ1激活P-smad2/3介導成-破骨偶聯(lián)失效及導致組織的纖維化可能是椎體骨質(zhì)疏松和椎間盤退變發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。補腎中藥可抑制椎體及椎間盤中TGFβ-Smad2/3信號通路,同時改善椎體及終板骨軟骨代謝和結構,延緩椎間盤退變,其可能通過調(diào)控TGFβ-Smad2/3信號通路而發(fā)揮作用。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R681.5;R580;R285.5

【參考文獻】

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6 李朋;魏曉燕;;補腎調(diào)肝方對SD大鼠膝骨關節(jié)炎軟骨下骨BMSCs OPG表達的影響[J];按摩與康復醫(yī)學;2015年13期

7 吳爽;蔣科;蔚們;黃莉;;骨代謝指標與骨關節(jié)炎患者骨密度變化的相關性研究[J];實用醫(yī)院臨床雜志;2015年03期

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本文編號：2799382