【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一種以胰島β細胞進行性功能衰竭導致血糖升高為主要病理生理過程的代謝性疾病�，F(xiàn)行的治療手段主要通過刺激患者體內(nèi)殘存胰島功能,達到暫時平穩(wěn)控制血糖水平的目的。但從遠期療效來看,隨著殘存胰島負擔的加重,最終會出現(xiàn)典型糖尿病癥狀和多種并發(fā)癥。近年來的研究已經(jīng)證實胰腺內(nèi)存在干細胞,研究糖尿病病理狀態(tài)下調(diào)控胰腺干細胞增殖分化為功能性胰島β細胞,有望從細胞和分子水平治療糖尿病。大量動物試驗研究表明,補充適量�；撬崮軌蚪档吞悄虿游镅撬�,改善糖尿病癥狀,防止并發(fā)癥的發(fā)生。本課題組前期通過動物試驗進一步證實,�；撬崮軌蛟黾覵TZ誘導的糖尿病大鼠胰島干細胞數(shù)量,上調(diào)胰腺干細胞表面標志物的表達,提示�；撬峥赡芡ㄟ^促進胰腺干細胞增殖及分化為成熟胰島β細胞發(fā)揮降糖作用,但具體調(diào)控機制尚不清楚。本研究擬從細胞和分子水平研究�；撬釋μ悄虿〈笫笠认俑杉毎鲋郴钚缘挠绊懠捌湔{(diào)控機制,以期為臨床應用�；撬岱乐稳祟惣皠游锾悄虿√峁├碚撘罁�(jù)。本研究主要分為三部分:(1)采用單次腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)的方法建立大鼠糖尿病模型,從模型大鼠胰腺導管分離、提取、純化胰腺干細胞,并進行體外傳代培養(yǎng);通過免疫細胞化學法鑒定胰腺干細胞表面標志物(Nestin、CK-19和PDX-1)的表達。(2)將糖尿病大鼠胰腺干細胞分為對照組(基礎培養(yǎng)基)和�；撬峤M(基礎培養(yǎng)基中加入10 mmol/L�；撬�)。通過免疫熒光化學法定性、定量檢測各組胰腺干細胞表面標志物(Nestin、CK-19和PDX-1)的表達情況;通過MTT法和流式細胞術分別檢測�；撬釋μ悄虿〈笫笠认俑杉毎鲋郴盍图毎芷诘淖饔�;通過實時熒光定量PCR及Western-blot技術檢測�；撬釋μ悄虿〈笫笠认俑杉毎鸓CNA和Ki67 mRNA及蛋白表達的影響。(3)應用基因表達譜芯片篩選對照組和牛磺酸組胰腺干細胞差異表達的基因,差異分析的篩選標準為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值Fold change≥2.0,且p0.05;通過GO富集分析和KEGG富集分析方法對差異基因參與的生物學功能和信號通路進行分析;應用實時熒光定量PCR法驗證差異表達基因。得出試驗結果如下:(1)采用單次腹腔注射STZ(50 mg/kg)的方法建立大鼠糖尿病模型,給藥72 h后大鼠血糖顯著升高,7天后表現(xiàn)出多飲、多食、多尿、消瘦的典型糖尿病癥狀,最終以血糖濃度≥16.7 mmol/L作為誘導糖尿病大鼠模型的成功標準,成模率為70%。此模型符合人類及動物糖尿病的發(fā)病特點,可以用于糖尿病大鼠胰腺干細胞的體外培養(yǎng)試驗。(2)應用機械剪碎法和膠原酶消化法成功提取了胰腺導管上皮細胞,通過貼壁培養(yǎng)、換液洗滌和傳代等方法,有效提高了胰腺干細胞純度;經(jīng)免疫細胞化學法鑒定干細胞表面標志物,Nestin、CK-19和PDX-1染色陽性細胞均達到85%以上,為后續(xù)試驗提供了可靠的材料。(3)應用免疫熒光化學法定性、定量檢測對照組和�；撬峤M胰腺干細胞表面標志物的表達,對免疫熒光染色陽性的圖片進行半定量分析。結果表明:Nestin、CK-19、PDX-1在各組細胞胞漿染色均為陽性,而Glucagon和Insulin染色均為陰性;經(jīng)�；撬崽幚�,Nestin、CK-19、PDX-1三種抗原的熒光強度雖然略有增強,但沒有顯著差異(p0.05)。說明從糖尿病大鼠提取的胰腺干細胞經(jīng)牛磺酸處理后,其形態(tài)和干細胞表面標志物表達沒有顯著改變,可在體外培養(yǎng)并穩(wěn)定傳代。(4)應用MTT法檢測體外培養(yǎng)糖尿病大鼠胰腺干細胞的增殖活力,�；撬嶙饔�24 h后胰腺干細胞增殖活力沒有顯著變化(p0.05);隨著�；撬嶙饔脮r間延長,48h、72 h、96 h�；撬峤M胰腺干細胞增殖活力顯著增強(p0.01)。(5)應用流式細胞術分析牛磺酸對糖尿病大鼠胰腺干細胞周期的影響,對照組胰腺干細胞S期百分比和增殖指數(shù)分別為15.73%和50.77%,經(jīng)�；撬崽幚�,S期百分比和增殖指數(shù)分別提高到28.57%和61.02%,說明牛磺酸顯著提高了糖尿病大鼠胰腺干細胞的增殖潛能(p0.01)。(6)應用實時熒光定量PCR和Western Blot法,在轉錄和蛋白水平檢測牛磺酸對細胞增殖相關抗原PCNA和Ki67表達的調(diào)控作用。結果顯示:與對照組相比,牛磺酸組PCNA mRNA表達增加1.49倍,Ki67 mRNA表達增加2.12倍;對照組糖尿病大鼠胰腺干細胞PCNA和Ki67蛋白的相對表達量分別為0.26和0.34,�；撬峤MPCNA和Ki67蛋白的相對表達量分別為0.56和0.53,說明牛磺酸顯著上調(diào)了PCNA與Ki67 m RNA和蛋白的表達(p0.01)。(7)以STZ誘導糖尿病大鼠為研究對象,應用基因表達譜分析技術,篩選�；撬崽幚砗蟠笫笠认俑杉毎町惐磉_基因。共篩選出差異表達的mRNA 3028個,其中上調(diào)mRNA 2268個(Fold change≥2,p0.05),下調(diào)mRNA 760個(Fold change≤-2,p0.05)。通過實時熒光定量PCR法對差異表達基因進行驗證,其變化趨勢與芯片結果基本一致,說明芯片數(shù)據(jù)結果可靠。(8)GO富集分析包括生物學過程、細胞組分、分子功能三大板塊:整張芯片注釋到生物學進程板塊中GO的基因數(shù)為17184個,注釋到GO的總靶基因數(shù)為1806個,差異基因參與調(diào)控的生物學進程依次為凋亡過程的負性調(diào)節(jié)、衰老、RNA聚合酶II啟動子轉錄的正性調(diào)節(jié)、對缺氧的反應、創(chuàng)傷修復等;整張芯片注釋到細胞組分板塊中GO的基因數(shù)為17746個,注釋到GO的總靶基因數(shù)為1863個,差異基因參與調(diào)控的細胞組分依次為細胞核、細胞質(zhì)、細胞外的外泌體、細胞膜、粘合斑等;整張芯片注釋到分子功能板塊中GO的基因數(shù)為16594個,注釋到GO的總靶基因數(shù)為1757個,差異基因參與調(diào)控的分子功能依次為蛋白結合、poly(A)RNA結合、ATP結合、蛋白質(zhì)復合物結合、蛋白質(zhì)異源二聚化活性等(FDR_bh0.05)。(9)KEGG富集分析顯示,整張芯片注釋到KEGG的基因數(shù)為7808個,其中上調(diào)總靶基因數(shù)為702個,下調(diào)總靶基因數(shù)為216個。經(jīng)�；撬崽幚砗�,上調(diào)差異基因參與的Pathway依次為腫瘤壞死因子信號通路、蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的加工、癌癥通路、NOD樣受體信號通路、癌癥相關蛋白聚糖等;下調(diào)差異基因參與的Pathway有2個,分別為酒精中毒和系統(tǒng)性紅斑狼瘡(FDR_bh0.05)。(10)通過生物信息學綜合分析,初步篩選出與牛磺酸促胰腺干細胞增殖相關的10條通路,分別是TNF信號通路、NF-κB信號通路、PI3K-AKt信號通路、Fox O信號通路、TGF-β信號通路、Ras信號通路、MAPK信號通路、Jak-STAT信號通路、Notch信號通路和Wnt信號通路。進一步分析各通路關鍵調(diào)控靶點的基因表達變化,確定NF-κB和Ras/ERK信號通路為�；撬岽僖认俑杉毎鲋趁芮邢嚓P的通路。通過實時熒光定量PCR法證實�；撬犸@著上調(diào)了NF-κB和Ras/ERK信號通路中關鍵靶點mRNA水平(Chuk、Egfr、Il1r1、Mapk1、Mki67、Nfkb1、Nras、Pcna、Pdgfra、Rela、Ripk1、Tlr4)(p0.01),表明�；撬嵬ㄟ^NF-κB和Ras/ERK信號通路促進了糖尿病大鼠胰腺干細胞的增殖。綜上所述,本研究通過腹腔注射STZ法建立了大鼠糖尿病模型,并從該模型大鼠胰腺導管成功提取、分離、純化胰腺干細胞,在體外穩(wěn)定傳代培養(yǎng);�；撬犸@著增加了糖尿病大鼠胰腺干細胞活力、細胞周期中DNA合成期的比例和增殖指數(shù),顯著上調(diào)了細胞增殖相關抗原m RNA和蛋白的表達;�；撬嵬ㄟ^NF-κB和Ras/ERK信號通路促進了糖尿病大鼠胰腺干細胞的增殖。
【學位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

第二章 STZ 誘導糖尿病大鼠模型的建立及胰腺干細胞的體外培養(yǎng)經(jīng)貼壁，細胞開始伸展，原代胰腺干細胞與成纖維細胞在這一時期很難直觀區(qū)分，呈扁平態(tài)鋪在培養(yǎng)板底部，聚集生長；接種 72-96 h，細胞達到 90%融合，可以傳二代以后的胰腺干細胞呈多角形，部分為長梭形，不再聚集生長。通常原代培養(yǎng) 5首次傳代，之后 3-5 天傳下一代，本研究選取第四代細胞按照相應試驗要求接種、。不同時期胰腺干細胞的形態(tài)見圖 2.1。

沈陽農(nóng)業(yè)大學博士學位論文2.3.3 免疫細胞化學法鑒定胰腺干細胞表面標志物利用免疫細胞化學（immunocytochemistry, ICC）方法，鑒定胰腺干細胞表面標志物Nestin、CK-19 和 PDX-1 的表達。在光學顯微鏡下觀察胰腺干細胞內(nèi) Nestin、CK-19、PDX-1 的表達情況，通過棕褐色抗原抗體反應產(chǎn)物可以在細胞爬片上定性、定位 Nestin、CK-19、PDX-1 的表達及分布。如圖 2.2 所示，Nestin、CK-19 和 PDX-1 陽性沉淀在干細胞胞漿均勻分布，陽性細胞率分別為(88±3.86)%、(85.6±3.92)%、(85.7±4.72)%（均大于 85%）；而 Glucagon 和 Insulin 染色為陰性，從而證實從糖尿病大鼠胰腺導管提取的細胞為胰腺干細胞。

Melting 60℃ to 94℃，Every 1.0℃，1 sIncubate at 25℃，for 1 min熔解曲線和擴增曲線，優(yōu)化反應條件分析國 BIONEER 公司生產(chǎn)的 ExicyclerTM 96 熒光定量儀分析，采用量統(tǒng)計。n Blot 技術檢測胰腺干細胞 PCNA 和 Ki67 蛋白的表達質(zhì)抽提據(jù)對照組和�；撬峤M樣本的質(zhì)量及體積加入相應體積的裂解樣in；溫冷凍離心機 4℃，12000 rpm，離心 10 min，分離上清為所得質(zhì)定量制標準曲線，見圖 3.1；

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 鐔魯濱;丁江舟;;非酶糖化抑制劑對STZ—糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)生率的影響[J];海軍醫(yī)學;1998年01期

2 費聿榮;韋丹;李明;張敏;張曉琳;丁文軍;楊建虹;;STZ誘導的糖尿病對骨密度和血清睪酮的影響(英文)[J];中國科學院研究生院學報;2007年02期

3 齊峰;邱昌龍;朱亮;趙舒;楊小溪;;黃芪桂枝五物湯對STZ誘發(fā)糖尿病大鼠周圍神經(jīng)保護作用[J];中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志;2013年06期

4 鄭里翔;STZ和alloxan聯(lián)合使用復制實驗性糖尿病大鼠模型[J];中國病理生理雜志;1999年08期

5 劉陽;宋淑娟;趙召霞;陳繼冰;李一;;STZ誘導小鼠糖尿病模型胸腺的改變[J];中國老年學雜志;2006年03期

6 徐國興,胡建章,王婷婷,鄭衛(wèi)東,林雯;HSP70在STZ—糖性白內(nèi)障發(fā)病機制中的研究(英文)[J];國際眼科雜志;2004年03期

7 文莉;陳家春;;紫紅獐牙菜對STZ糖尿病小鼠的降糖作用[J];中國藥師;2007年02期

8 王劍勇;張曉明;張惠燕;;血小板反應素1在STZ誘導大鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變的表達研究[J];分子細胞生物學報;2006年05期

9 畢春花;王艷;;血管內(nèi)皮生長因子和內(nèi)抑素在STZ大鼠腎臟中的表達及意義[J];中國中西醫(yī)結合腎病雜志;2008年04期

10 朱曉波;閆智宏;徐志偉;;維生素A結合胰島素干預對STZ糖尿病大鼠血糖的影響[J];南京醫(yī)科大學學報(自然科學版);2010年08期

相關會議論文 前10條

1 王劍勇;;血小板反應素1在STZ誘導大鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變的表達研究[A];2006年浙江省眼科學術會議論文集[C];2006年

2 費聿榮;韋單;李明;張敏;張曉琳;丁文軍;楊建虹;;STZ誘導的糖尿病對骨密度和血清睪酮的影響[A];全國中西醫(yī)結合內(nèi)分泌代謝病學術會議論文匯編[C];2006年

3 陳剛;林麗香;莊維持;姚瑾;黃惠彬;林帆;梁繼興;林建立;;用基因芯片研究STZ誘導的糖尿病腦血管病大鼠全腦的基因表達譜[A];中華醫(yī)學會第六次全國內(nèi)分泌學術會議論文匯編[C];2001年

4 黃海泉;劉必成;劉殿閣;羅冬冬;馬坤嶺;;厄貝沙坦對STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟CTGF表達的影響[A];“中華醫(yī)學會腎臟病學分會2004年年會”暨“第二屆全國中青年腎臟病學術會議”論文匯編[C];2004年

5 黃海泉;劉必成;陰東平;劉殿閣;羅冬冬;;STZ誘導糖尿病大鼠腎臟CTGF表達改變及意義探討[A];“中華醫(yī)學會腎臟病學分會2004年年會”暨“第二屆全國中青年腎臟病學術會議”論文匯編[C];2004年

6 吳東方;莊躍宏;陳秀芳;趙麗娜;楊曉東;唐茂林;;胰島素依賴型糖尿病對大鼠隨意皮瓣存活能力的影響[A];中國解剖學會2012年年會論文文摘匯編[C];2012年

7 崔瑾;韓姣姣;李鳳翱;李鳳翱;湯紹芳;劉萍;邱明才;張鵬;;1,25-二羥維生素D3對糖尿病大鼠肺臟病變的保護作用[A];中華醫(yī)學會第十二次全國內(nèi)分泌學學術會議論文匯編[C];2013年

8 鄭濱珠;袁鳳山;楊潤橋;;自體干細胞激活療法治療糖尿病大鼠過程中血細胞及生化改變[A];中華醫(yī)學會第十二次全國內(nèi)分泌學學術會議論文匯編[C];2013年

9 劉銅華;呂仁和;高彥彬;;中醫(yī)藥防治糖尿病及并發(fā)癥的作用途徑[A];糖尿�。ㄏ什。┲嗅t(yī)診治薈萃——全國第五次中醫(yī)糖尿病學術大會論文集[C];1999年

10 石鳳英;王堯;;靈芝對糖尿病大鼠腎臟形態(tài)學及微量白蛋白尿的作用[A];中國康復醫(yī)學會第三次康復治療學術大會論文匯編[C];2002年

相關重要報紙文章 前9條

1 郭賽珊　梁曉春 潘明政;中西醫(yī)結合治療糖尿病慢性并發(fā)癥可顯著改善癥狀[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

2 本報記者 王樂羊;中西醫(yī)結合防治糖尿病大有可為[N];中國中醫(yī)藥報;2002年

3 北京協(xié)和醫(yī)院 梁曉春;對中醫(yī)治糖尿病并發(fā)癥研究的思考[N];中國中醫(yī)藥報;2011年

4 劉燕玲;肥胖是糖尿病的源頭[N];健康報;2006年

5 仝小林;糖尿病慢性并發(fā)癥論治[N];中國中醫(yī)藥報;2003年

6 汪敏;糖尿病皮膚易損元兇找到[N];衛(wèi)生與生活報;2003年

7 林蘭;中西醫(yī)結合治療糖尿病的前景[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

8 北京協(xié)和醫(yī)院中醫(yī)科主任 梁曉春;糖尿病周圍神經(jīng)病變的中西醫(yī)治療進展[N];中國醫(yī)藥報;2009年

9 本報記者 劉艷芳;糖尿病干預不能忽視抗氧化[N];中國食品報;2012年

相關博士學位論文 前10條

1 梁巍巍;�；撬釋TZ誘導糖尿病大鼠胰腺干細胞增殖作用的研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學;2017年

2 于佳一;次血紅素6肽結構鑒定及其保護STZ-誘導2型糖尿病大鼠作用研究[D];吉林大學;2015年

3 馮偉偉;蘋果酸鉻對2型糖尿病大鼠的降血糖活性、作用機制及安全性初探[D];江蘇大學;2015年

4 劉宇;糖尿病來源的骨髓間充質(zhì)干細胞治療心肌梗死的相關研究[D];第四軍醫(yī)大學;2015年

5 李維辛;GLP-1受體激動劑治療糖尿病的循證評價和對糖尿病大鼠胃動力影響的機制研究[D];蘭州大學;2012年

6 田麗;糖尿病周圍神經(jīng)病運動纖維的早期評價[D];天津醫(yī)科大學;2014年

7 柳忠豪;糖尿病對口腔種植體骨整合影響的作用機制研究[D];山東大學;2015年

8 李波;飽和富氫液對糖尿病神經(jīng)病變的保護作用及機制研究[D];天津醫(yī)科大學;2015年

9 米佳;Vaspin調(diào)控糖尿病炎癥通路及苦酸通調(diào)法的干預機制研究[D];長春中醫(yī)藥大學;2015年

10 林宣佑;從SCAP/SREBP脂代謝信號轉導途徑探討苦酸通調(diào)方調(diào)控2型糖尿病胰島素抵抗的作用機制[D];長春中醫(yī)藥大學;2015年

相關碩士學位論文 前10條

1 鄭騰飛;姜黃素對STZ誘導的糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護作用[D];湖北科技學院;2015年

2 劉勵文;消渴痹通膠囊對STZ大鼠神經(jīng)細胞氧化應激的影響[D];長春中醫(yī)藥大學;2016年

3 唐欣;石斛合劑對STZ誘導的認知功能障礙大鼠腦組織保護機制研究[D];福建中醫(yī)藥大學;2017年

4 石驍;大黃素對STZ大鼠腎臟組織Toll樣受體4、NF-κB及白細胞介素-6表達影響的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2017年

5 何超;Peroxiredoxin Ⅱ在STZ誘導的胰島β-cell損傷中的保護作用研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學;2017年

6 李云霞;白藜蘆醇及雌二醇延緩STZ所致卵巢切除鼠糖尿病發(fā)生的分子機制研究[D];蘭州大學;2017年

7 季芳;甘草降糖分散片對STZ誘導的糖尿病小鼠的抗糖尿病作用及其質(zhì)量標準研究[D];蘭州大學;2012年

8 吳潔;速降糖對STZ糖尿病大鼠早期周圍神經(jīng)病變防治作用的實驗研究[D];湖北中醫(yī)學院;2004年

9 田寶明;低血糖指數(shù)掛面的研制及其對糖尿病大鼠糖脂代謝影響的研究[D];西南大學;2015年

10 黃瓊;姜黃素對糖尿病大鼠肺組織損傷的保護作用及其可能機制[D];湖北科技學院;2015年

本文編號：2795643