【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一種退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病,迄今為止尚無明確的發(fā)病機制和有效的治療方法。AD的發(fā)病機制學說有β淀粉樣斑塊沉積、Tau蛋白磷酸化、神經(jīng)炎癥、線粒體功能障礙和氧化應激等假說。體內(nèi)β淀粉樣蛋白(amyloid-βprotein,Aβ)有多種肽段,常見的為Aβ_(42)和Aβ_(40),其中Aβ_(42)具有更高的神經(jīng)毒性,可誘導細胞的凋亡、氧化應激和炎癥反應等。目前,AD的治療藥物僅用于改善認知功能,且單靶點藥物治療在臨床上表現(xiàn)出有限的療效,尚無根治方法。中藥在AD的臨床治療中發(fā)揮著重要角色,中藥活性成分治療中樞系統(tǒng)性疾病,需要跨血腦屏障(Blood-brain barrier,BBB)轉(zhuǎn)運至腦部靶標部位。BBB是存在于腦組織和血液之間由星形膠質(zhì)細胞足突、腦微血管內(nèi)皮細胞及其基底膜組成的具有選擇功能的屏障。BBB上存在多種轉(zhuǎn)運外排蛋白,例如P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),乳腺癌耐藥蛋白(BCRP)等,這些轉(zhuǎn)運蛋白作為主動的外排泵,可以將底物從大腦實質(zhì)中排出,保護大腦免受有毒物質(zhì)的侵害,另一方面,通過限制某些藥物轉(zhuǎn)運至大腦,降低藥物的治療效果,對維持大腦平衡態(tài)具有重要作用。中藥丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bunge.)的干燥根及根莖,在AD的臨床治療中使用頻次較高。然而,丹參治療AD的機制尚未明確,跨BBB轉(zhuǎn)運的情況也未知。為此,本文進行了三個方面的研究:1、基于UHPLC-QTOF/MS的細胞代謝組學對丹參保護AD模型細胞的機制研究目的:探尋AD有關的潛在生物標志物,闡明丹參對AD細胞模型的保護作用機制。方法:制備Aβ_(1-42)寡聚體,用其誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞(hBMEC)損傷建立AD細胞模型,并評價丹參提取液對模型的保護作用。采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜(UHPLC-QTOF/MS)結合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的方法,找尋與AD細胞模型相關的差異代謝物并對其進行鑒別。通過分析代謝通路,闡明丹參對AD細胞模型的保護作用機制。結果:(1)將Aβ_(1-42)多肽單體采用4℃孵育24 h成功制備得到Aβ_(1-42)寡聚體,用10μM Aβ_(1-42)寡聚體誘導細胞損傷,建立AD細胞模型;100μg/mL丹參提取液能顯著地提高模型細胞的活性。(2)篩選出33個與AD模型細胞有關的潛在生物標志物。在丹參保護作用下,大部分生物標志物恢復到正常細胞水平。(3)發(fā)現(xiàn)AD模型細胞與丙氨酸-天冬氨酸和谷氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、色氨酸代謝、泛酸和輔酶A生物合成、組氨酸代謝、苯丙氨酸代謝和甘油磷酸代謝等通路的紊亂密切相關。結論:Aβ_(1-42)寡聚體誘導的AD細胞模型與上述代謝通路的紊亂密切相關;丹參提取液對細胞模型的保護作用可能與參與上述代謝途徑的調(diào)節(jié)有關;本研究使用細胞代謝組學的方法闡明中藥丹參對AD細胞模型的保護作用機制,尚屬首次。2、基于體外BBB模型的丹參多成分跨膜轉(zhuǎn)運研究目的:探討丹參多種成分跨BBB轉(zhuǎn)運機制,闡明丹參成分與轉(zhuǎn)運蛋白間的關系。方法:利用hBMEC細胞建立BBB單層細胞模型,并進行評價。選擇合適濃度的丹參多成分丹參酮IIA、丹參酮I、二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸、原兒茶醛和原兒茶酸進行跨BBB轉(zhuǎn)運實驗,并通過建立的轉(zhuǎn)運體系中丹參多成分的高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜(HPLC-QQQ/MS)定量方法檢測上述多成分的含量,分析各成分跨BBB轉(zhuǎn)運情況。結果:采用hBMEC細胞建立BBB細胞模型的跨膜電阻值為33.04±5.02Ω·cm~2,熒光素鈉的通透系數(shù)為(3.42±0.47)×10~(-5) cm/s;同時P-gp抑制劑維拉帕米可以抑制羅丹明123在該模型中的外排,增加羅丹明123在該模型中的吸收。建立HPLC-QQQ/MS對轉(zhuǎn)運體系(HBSS)中7種丹參成分含量的檢測方法,專屬性好,準確度和精密度、基質(zhì)效應符合要求;本研究中丹參酮IIA、二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸、原兒茶醛和原兒茶酸的Papp_((AP-BL))分別為(3.757±1.723)×10~(-8)、(4.643±2.012)×10~(-6)、(4.977±1.587)×10~(-6)、(2.147±1.010)×10~(-5)、(1.516±0.179)×10~(-5)和(4.369±1.410)×10~(-5) cm/s,上述化合物分別與P-gp抑制劑維拉帕米或BCRP抑制劑Ko143配伍作用后,外排率(ER)均沒有顯著性變化,且ER均小于2。結論:中藥丹參的活性成分丹參酮IIA、二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸、原兒茶醛和原兒茶酸在BBB細胞模型中可以跨膜轉(zhuǎn)運,且不受P-gp和BCRP抑制劑的影響,上述化合物在BBB模型上的吸收可能為單純的透細胞被動轉(zhuǎn)運。3、大鼠血漿及腦組織中丹參6種成分含量測定及跨血腦屏障轉(zhuǎn)運研究目的:探討丹參成分在動物體內(nèi)跨BBB轉(zhuǎn)運情況,闡明丹參成分與轉(zhuǎn)運蛋白間的關系。方法:建立血漿和腦組織中丹參多成分的HPLC-QQQ/MS定量方法,采用液液萃取方式處理血漿樣品和腦組織樣品,梯度洗脫,流速為0.400 mL/min,采用雙內(nèi)標進行定量,質(zhì)譜采用多反應監(jiān)測模式。36只大鼠隨機均分為對照組和抑制劑組,抑制劑組大鼠腹腔注射維拉帕米(40 mg/kg,1 mL/200g),對照組大鼠腹腔注射生理鹽水(1 mL/200g),60分鐘后,所有大鼠均灌胃丹參提取物(25 g/kg,4 mL/200 g)。分別在灌胃丹參提取液后30、60和90分鐘,按照給藥順序各收集6只對照組、6只抑制劑組大鼠的血漿和腦組織。通過測定樣品中丹參各成分含量,分析其跨血腦屏障轉(zhuǎn)運情況,并評價P-gp抑制劑維拉帕米對丹參成分跨血腦屏障轉(zhuǎn)運的影響。結果:血漿和腦組織HPLC-QQQ/MS方法中6個成分的專屬性良好,日內(nèi)和日間精密度RSD均小于13.72%,基質(zhì)效應為72.49-138.29%,穩(wěn)定性符合要求;對照組大鼠血漿中能檢測到隱丹參酮、二氫丹參酮I、丹參酮I、咖啡酸和原兒茶酸,與對照組相比,抑制劑組大鼠血漿中隱丹參酮含量升高,而二氫丹參酮I、丹參酮I、咖啡酸和原兒茶酸的含量降低。對照組大鼠腦組織中僅檢測到隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮I;與對照組相比,抑制劑組大鼠腦組織中隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮I的含量和腦血比均降低。結論:隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮I可以跨血腦屏障轉(zhuǎn)運,而咖啡酸和原兒茶酸不能跨BBB向腦組織轉(zhuǎn)運。綜上所述,丹參對AD模型細胞的保護作用,進一步驗證說明其臨床治療效果。丹參酮IIA、二氫丹參酮I、隱丹參酮、咖啡酸、原兒茶醛和原兒茶酸可以跨BBB細胞模型轉(zhuǎn)運,P-gp和BCRP抑制劑均不影響其體外跨膜轉(zhuǎn)運;在動物體內(nèi),僅隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮I可以跨血腦屏障轉(zhuǎn)運,雖然有研究認為隱丹參酮是P-gp底物,但是本研究發(fā)現(xiàn)P-gp抑制劑維拉帕米能降低隱丹參酮、二氫丹參酮I和丹參酮I的腦血比。本研究認為二氫丹參酮I、丹參酮I、咖啡酸和原兒茶酸可能不是P-gp底物。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

1-42寡聚體 SDS-PAGE 凝膠電泳-考馬斯horesis-coomassie brilliant blue staining o胞模型聚體作用于 hBMEC 細胞 24 h，經(jīng) MT條件下的 Aβ1-42寡聚體能顯著性降低 h關性，即 Aβ1-42寡聚體濃度越高，作用獻調(diào)研，為使細胞能保持一定活性，選型細胞，進行后續(xù)實驗。

Aβ1-42寡聚體 SDS-PAGE 凝膠電泳-考馬斯亮藍ophoresis-coomassie brilliant blue staining ofAβ胞模型寡聚體作用于 hBMEC 細胞 24 h，經(jīng) MTT 法度條件下的 Aβ1-42寡聚體能顯著性降低 hBME相關性，即 Aβ1-42寡聚體濃度越高，作用細胞文獻調(diào)研，為使細胞能保持一定活性，選擇 模型細胞，進行后續(xù)實驗。

經(jīng) MTT 法測得的細胞活性如圖2-3.A 所示，6.25-200μg/mL 丹參提取物能提高細胞的活性，并呈現(xiàn)出濃度正相關性，即丹參提取物濃度越高，作用細胞后其活性比正常培養(yǎng)下細胞的活性更高。但是當?shù)⑻崛∥餄舛却笥?200μg/mL，表現(xiàn)出細胞毒性，降低細胞的活性。因此，選擇對細胞活性沒有抑制作用的丹參提取物（50、100、200 μg/mL）進行后續(xù)實驗。2、陽性藥石杉堿甲對 hBMEC 細胞的毒性不同濃度石杉堿甲作用于 hBMEC 細胞 24 h，經(jīng) MTT 法測得的細胞活性如圖 2-3. B 所示，濃度為 1.562-25 μM 的石杉堿甲能提高細胞的活性，50 μM 石杉堿甲作用于細胞 24h 后的細胞活性與對照組細胞活性基本相同。但是當石杉堿甲濃度大于 100μM，表現(xiàn)出細胞毒性，降低細胞的活性。因此，選擇對細胞活性沒有抑制作用的石杉堿甲三個較高濃度（12.5、25、50 μM）進行后續(xù)實驗。圖 2-3. 不同濃度丹參和石杉堿甲對 hBMEC

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