【摘要】：目的:何首烏作為蓼科植物何首烏(Polygonum multiflorum Thunb)的干燥塊根,最早記載于史書《開寶本草》中;性微溫、味苦、甘、澀,臨床上應(yīng)用分為生首烏和制首烏:生何首烏主要用于消癰解毒、潤腸通便;而制何首烏則主要用于滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨、補(bǔ)精益血、治療白發(fā)。作為何首烏中的主要蒽醌類成分,大黃素在體內(nèi)分為結(jié)合型和游離型兩種,其藥理學(xué)作用廣泛,包括抗癌、殺菌消炎等作用,并且對肝癌、肺癌、乳腺癌等治療作用顯著。隨著對何首烏廣泛使用以及對中藥安全性評價(jià)和監(jiān)督的深入,國內(nèi)外相繼出現(xiàn)了關(guān)于何首烏致肝腎損傷的臨床病例報(bào)道,其安全性問題引起了國內(nèi)外學(xué)者的高度關(guān)注。目前,普遍認(rèn)為何首烏的肝損傷作用主要與其所含蒽醌類成分有關(guān),如大黃素、大黃酸對肝細(xì)胞的直接毒性作用等。細(xì)胞色素P450(CYP)作為人體重要的藥物代謝酶,參與90%以上臨床藥物的代謝,當(dāng)其活性受到抑制或被誘導(dǎo)時(shí)易發(fā)生藥物相互作用和不良反應(yīng),而何首烏致肝毒性與CYP450關(guān)系尚未見報(bào)道。因此,探討何首烏對CYP450影響作用,對闡述其毒性作用和機(jī)制具有重要意義。本研究將從藥物代謝酶角度切入,從體內(nèi)和體外水平上發(fā)現(xiàn)和研究何首烏中大黃素致肝損傷的毒性機(jī)制。方法:(1)采用不同劑量大黃素處理L02細(xì)胞,MTS法檢測細(xì)胞存活率從而確定給藥濃度,并依次用qRT-PCR及Western-blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)CYP450亞型的mRNA及蛋白表達(dá)。(2)用EMSA凝膠電泳及報(bào)告基因技術(shù)檢測大黃素處理L02細(xì)胞后對相關(guān)核受體轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控CYP450的影響。(3)siRNA或抑制劑共處理降低細(xì)胞內(nèi)AhR的表達(dá),qRT-PCR及Western-blot檢測AhR敲低前后大黃素對L02細(xì)胞CYP1A1表達(dá)的影響;用Fluo/4-AM熒光探針標(biāo)記L02細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測CYP1A1敲低前后大黃素對L02胞內(nèi)Ca~(2+)濃度影響的變化;高內(nèi)涵檢測細(xì)胞內(nèi)GSH、MMP、ROS的影響。(4)整體動(dòng)物上建立CYP1A1誘導(dǎo)性和抑制性動(dòng)物模型,檢測大黃素在CYP450誘導(dǎo)或抑制的條件下對小鼠肝損傷作用。結(jié)果:(1)1~100μM大黃素對L02細(xì)胞有不同程度損傷,高濃度下表現(xiàn)出明顯的肝細(xì)胞毒性作用;(2)大黃素在低(5μM)、中(10μM)、高(20μM)濃度作用于L02時(shí),可劑量依賴性誘導(dǎo)CYP1A1的mRNA及蛋白表達(dá);(3)EMSA、報(bào)告基因結(jié)果顯示,大黃素誘導(dǎo)的CYP1A1表達(dá)與其轉(zhuǎn)錄因子AhR的激活有關(guān);(4)敲低CYP1A1表達(dá)條件下,可逆轉(zhuǎn)大黃素所致的L02細(xì)胞凋亡及MMP的下降;(5)大黃素能顯著加重CYP1A1誘導(dǎo)型C57小鼠的肝損傷,并增強(qiáng)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子ATF-4、CHOP的表達(dá),進(jìn)一步激活Caspase3而誘導(dǎo)caspase9及其相關(guān)凋亡分子的表達(dá)。結(jié)論:在大黃素影響CYP450各亞型酶作用的篩選過程中,首次發(fā)現(xiàn)大黃素呈時(shí)間和濃度依賴性誘導(dǎo)CYP1A1、CYP1B1 mRNA和蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)該誘導(dǎo)效應(yīng)起始于AhR與CYP1A1調(diào)控區(qū)的結(jié)合階段,即大黃素能夠激活A(yù)hR進(jìn)而增強(qiáng)其對CYP1A1的轉(zhuǎn)錄活性。大黃素對CYP1A1的誘導(dǎo)效應(yīng)是否與何首烏致肝損傷有關(guān),本研究依次從細(xì)胞凋亡、高內(nèi)涵篩選(活性氧、線粒體膜電位、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激)、鈣瞬變、western blot技術(shù)結(jié)合分子生物學(xué)驗(yàn)證技術(shù)等對與肝毒性密切相關(guān)的多項(xiàng)指標(biāo)結(jié)合體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行考察。結(jié)果表明,大黃素呈劑量依賴性誘導(dǎo)L02肝細(xì)胞的凋亡;誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、降低細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位和GSH的含量;誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和鈣離子的累積;同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)大黃素能激活小鼠肝組織caspase9、caspase3活性進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為了驗(yàn)證CYP1A1的誘導(dǎo)與肝毒性的關(guān)系,本研究采用相關(guān)抑制劑或誘導(dǎo)劑進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)當(dāng)大黃素與AhR的特異性抑制劑CH223191共處理時(shí),與未加CH223191相比,細(xì)胞活性能顯著提高,線粒體膜電位MMP的降低被明顯改善,活性氧ROS的產(chǎn)生得到逆轉(zhuǎn),動(dòng)物在給予CYP1A1抑制劑后也明顯減輕了大黃素所致的肝損傷。根據(jù)細(xì)胞水平和動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測大黃素活化AhR并誘導(dǎo)CYP1A1活性是加重肝損傷的重要原因,其具體機(jī)制可能與活化AhR后顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子累積,持續(xù)的氧化應(yīng)激與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而激活caspase途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān);同時(shí)大黃素對CYP1A的誘導(dǎo)是否參與了其自身的代謝轉(zhuǎn)化并導(dǎo)致肝毒性也有待進(jìn)一步深入研究。因此我們認(rèn)為CYP1A1可能是大黃素加重何首烏肝損傷的重要調(diào)控靶點(diǎn),即大黃素可能通過AhR-CYP1A1通路引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷的發(fā)生;提示長期使用何首烏誘導(dǎo)CYP1A或與CYP1A誘導(dǎo)性藥物(含中藥)合用可能具有潛在的肝毒性風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

Fig. 1-1 Effect of Polygonum multiflorum Thunb on cell viability of L02 cells ( x ± s)圖 1-1.何首烏中主要成分對 L02 細(xì)胞活力的影響 (x ± s)1.3.2 大黃素對 L02 細(xì)胞活力的影響依據(jù)上述肝細(xì)胞毒性篩選結(jié)果，選取 Emodin 為進(jìn)一步研究對象。以不同濃度度處理 L02 細(xì)胞 24 和 48h 后，MTS 方法檢測細(xì)胞活性，結(jié)果表明隨著大黃素濃度賴性降低 L02 細(xì)胞存活率，給藥 48h 細(xì)胞存活率較 24h 存活率更低下，說明大黃素細(xì)胞毒性同樣具有時(shí)間依賴性。測定結(jié)果采用 GraphPad Prism 5 軟件擬合計(jì)算 IC(圖 1-2)。

1.3.3 乳酸脫氫酶(LDH)比色法檢測 L02 細(xì)胞損傷為了檢測 Emodin 對 L02 細(xì)胞的損傷，用濃度梯度分別處理 L02 細(xì)胞 24h 和結(jié)果顯示處理 24h 后 LDH 釋放率無明顯變化；而處理 48h 后，隨著 Emodin 濃度高，LDH 的釋放率逐漸增大(圖 1-3)，進(jìn)一步提示 Emodin 致細(xì)胞毒性具有時(shí)間和依賴性，與 MTS 結(jié)果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)圖 1-2 大黃素對 L02 細(xì)胞活力的影響 (x ± s)

脫氫酶(LDH)比色法檢測 L02 細(xì)胞損傷測 Emodin 對 L02 細(xì)胞的損傷，用濃度梯度分別處理 L02 細(xì)胞理 24h 后 LDH 釋放率無明顯變化；而處理 48h 后，隨著 Emo釋放率逐漸增大(圖 1-3)，進(jìn)一步提示 Emodin 致細(xì)胞毒性具有 MTS 結(jié)果相一致。Fig. 1-2 Effect of Emodin on cell viability of L02cells( x ± s)圖 1-2 大黃素對 L02 細(xì)胞活力的影響 (x ± s)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2794134