發(fā)布時(shí)間：2020-08-13 04:31

【摘要】：一、目的:胃癌的惡性程度高,在早期時(shí)即可發(fā)生惡性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,是致使胃癌患者診療失敗的最主要原因之一。大量研究闡明,惡性腫瘤的侵襲以及轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的關(guān)系十分的密切。本實(shí)驗(yàn)主要研究左金方及其主要活性成分小檗堿、吳茱萸堿對(duì)人胃癌細(xì)胞(SGC7901細(xì)胞)的遷移侵襲能力以及EMT的一些特征性的標(biāo)志物的影響,從而為中醫(yī)藥在臨床上治療胃癌及其轉(zhuǎn)移提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。二、方法:(1)小檗堿抑制SGC7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究1、運(yùn)用四甲基偶氮唑鹽(MTT)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的影響,用來(lái)確定之后實(shí)驗(yàn)研究的小檗堿濃度。2、采取劃痕實(shí)驗(yàn)方法與transwell的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。3、Real-Time qPCR技術(shù)檢測(cè)小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin基因轉(zhuǎn)錄的影響。4、免疫熒光與Western blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)E-cadherin、Zo-1、N-cadherin、Vimentin、MMP-9、Snail1等EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)和AKT、pAKT等通路蛋白的表達(dá)。5、Western blot檢測(cè)PI3K/AKT抑制劑(LY294002)和激動(dòng)劑(IGF-1)單獨(dú)或與小檗堿聯(lián)合作用對(duì)E-cadherin、N-cadherin及pAKT表達(dá)的影響。(2)吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞的侵襲遷移能力以及EMT的影響1、MTT實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)吳茱萸堿具有抑制SGC7901細(xì)胞活力影響的作用,同時(shí)明確了用來(lái)后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的吳茱萸堿濃度。2、劃痕實(shí)驗(yàn)方法與transwell的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。3、運(yùn)用Western blot來(lái)檢測(cè)吳茱萸堿對(duì)SGC7901上皮蛋白E-cadherin、間質(zhì)蛋白N-cadherin的影響作用。(3)左金方及其主要成分小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的比較1、制備左金方凍干粉,再選用高效液相色譜(HPLC)方法,對(duì)比小檗堿對(duì)照品,明確左金方凍干粉的純度和小檗堿含量。2、MTT檢測(cè)左金方對(duì)SGC7901生長(zhǎng)的影響。3、通過(guò)劃痕、transwell的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)研究比較左金方和小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移力、侵襲力的影響。4、Western blot試驗(yàn)研究比較左金方和小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin兩種蛋白表達(dá)的影響。三.結(jié)果:(1)小檗堿抑制SGC7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用及機(jī)制研究1、MTT結(jié)果顯示小檗堿對(duì)SGC7901生長(zhǎng)具有抑制作用,又表現(xiàn)出了一定的時(shí)效和量效關(guān)系;小檗堿處理作用24 h后,半數(shù)抑制濃度(IC_(50))是127μM。10、20、40μM小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞活性有抑制作用但殺傷作用弱,故選擇此濃度范圍做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、劃痕方法、Transwell實(shí)驗(yàn)顯示小檗堿能夠明顯地抑制SGC7901細(xì)胞的遷移力與侵襲力,并呈現(xiàn)出濃度依賴性。3、用小檗堿處理作用細(xì)胞24h后能明顯提高E-cadherin mRNA的表達(dá),且有濃度依賴關(guān)系。20μM小檗堿,40μM小檗堿都能夠降低N-cadherin mRNA的轉(zhuǎn)錄水平(P0.05)。4、免疫熒光及Western bolt檢測(cè)小檗堿作用SGC7901細(xì)胞24h結(jié)果顯示,小檗堿可以明顯增加SGC7901細(xì)胞Zo-1,E-cadherin的表達(dá),與之相反,又能減低Vimentin、N-cadherin、Snail1、MMP-9這些蛋白的表達(dá)水平。PI3K/AKT通路蛋白情況顯示,隨著濃度的增加,小檗堿能顯著性降低pAKT表達(dá)水平。5、Western bolt結(jié)果顯示將小檗堿40μM加入到已由激活劑IGF-1(100 ng/mL)預(yù)處理的SGC7901細(xì)胞中作用24 h,與IGF-1單獨(dú)影響的細(xì)胞相對(duì)比,不難發(fā)現(xiàn)E-cadherin蛋白顯著上升,N-cadherin、pAKT等則顯著下降。將抑制劑LY294002(10μM)單獨(dú)或與小檗堿聯(lián)合作用于SGC7901細(xì)胞,各組間E-cadherin、N-cadherin、pAKT的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)吳茱萸堿影響SGC7901細(xì)胞侵襲遷移及EMT1、MTT結(jié)果顯示出吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞的殺傷抑制的作用強(qiáng),且有明顯時(shí)效和量效關(guān)系,吳茱萸堿作用SGC7901細(xì)胞24 h的IC_(50)為1.5μM。0.1、0.2、0.4μM吳茱萸堿作用SGC7901細(xì)胞的殺傷作用較弱,故選擇此濃度范圍做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2、在劃痕試驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與control組的結(jié)果相比較:0.2μM吳茱萸堿,0.4μM吳茱萸堿都能夠明顯地抑制SGC7901的遷移力、侵襲力。3、Western bolt示:0.1μM、0.2μM、0.4μM的吳茱萸堿作用SGC7901 24h后,EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、N-cadherin這兩種蛋白表達(dá)卻無(wú)明顯改變。(3)左金方及其主要成分小檗堿對(duì)SGC7901細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的比較1、HPLC鑒定供試品即制備的左金方凍干粉雜峰少,純度高,左金方中小檗堿含量較高。根據(jù)小檗堿特征峰面積,采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算,測(cè)定得每克左金方凍干粉含有0.0985克小檗堿,即約占9.85%。2、MTT結(jié)果顯示左金方對(duì)SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制有明顯時(shí)效和量效關(guān)系,對(duì)比40μM(16.3 mg/L)小檗堿,165 mg/L(含16.3 mg/L小檗堿)左金方凍干粉對(duì)SGC7901細(xì)胞抑制作用更強(qiáng),殺傷率達(dá)半數(shù)以上。3、劃痕方法、transwell的結(jié)果都顯示,左金方及小檗堿可以顯著抑制SGC7901細(xì)胞的遷移力、侵襲力,但左金方組與小檗堿組的遷移率、侵襲率卻無(wú)明顯差異。4、Western bolt結(jié)果顯示:用165 mg/L左金方組與16.3 mg/L小檗堿組這兩個(gè)組之間的E-cadherin以及N-cadherin的表達(dá)量并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。左金方及小檗堿均能明顯抑制SGC7901細(xì)胞的EMT,且在左金方發(fā)揮主要作用的可能為小檗堿。四、結(jié)論:1、小檗堿可以明顯地抑制SGC7901細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移,且通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT通路抑制SGC7901細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。2、吳茱萸堿對(duì)SGC7901細(xì)胞遷移和侵襲同樣有明顯抑制作用,但是對(duì)EMT并沒(méi)有明顯抑制作用。3、左金方能夠抑制SGC7901細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲及遷移,而且能抑制SGC7901胃癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化;除小檗堿、吳茱萸堿外的其他成分也有協(xié)同抑制胃癌細(xì)胞的作用,但在抑制EMT方面,小檗堿在左金方復(fù)方中為最主要的藥效成分。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

1.3.2 吳茱萸堿的藥理研究吳茱萸堿（ evodiamine, Evo），它作為中藥吳茱萸中最重要的生物堿之一,是吳茱萸的有效活性單體。吳茱萸堿分子式是C19H17N3O（它的分子結(jié)構(gòu)式可見(jiàn)于圖1-1),相對(duì)分子質(zhì)量為 303. 36。吳茱萸堿在各個(gè)方面都有強(qiáng)大的臨床藥理作用,具備廣泛的藥用價(jià)值。目前已發(fā)現(xiàn)它具有抗癌、降糖、抗炎、鎮(zhèn)痛、保護(hù)心臟等多種藥理學(xué)活性。吳茱萸堿抗腫瘤效應(yīng)強(qiáng),主要作用多與誘導(dǎo)腫瘤調(diào)亡，產(chǎn)生周期阻滯,抑腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等有關(guān),當(dāng)中的作用機(jī)制如網(wǎng)絡(luò)涉及多條通路的激活。譚宇蕙等[64, 65]實(shí)驗(yàn)研究證明吳茱萸堿能夠殺傷人肝癌細(xì)胞 HepG2，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡；且發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能夠通過(guò)激活 p53 、上調(diào) P21 達(dá)到顯著抑制 786-0 腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)的效果。Takada 等[66]就吳茱萸堿對(duì) NF-κB 等多種癌基因活化的影響進(jìn)行研究, 結(jié)

圖 1-2 小檗堿的結(jié)構(gòu)式erine ，BBR ），又可以稱為黃連素，它是啉類生物堿。黃連主要是來(lái)自于毛茛科中黃小檗堿分子式為 C20H18NO4（它的分子結(jié)構(gòu)床上歷來(lái)被用來(lái)解熱，祛毒，消炎，抗腸道堿還擁有擴(kuò)張血管、抗心律失常、抗血小板藥效。小檗堿治療疾病涵蓋多個(gè)系統(tǒng)，其中作用用機(jī)制可能與干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡路、影響 IL-8 表達(dá)和 PGE2 生成、降低端粒有關(guān)[69]。有研究發(fā)現(xiàn)小檗堿通過(guò)抑制 MMP 力[70]。小檗堿可通過(guò)抑制 ERK 通路及 COX1]。此外，小檗堿對(duì)正常肝細(xì)胞無(wú)毒，又能效

圖 2-1 MTT 法檢測(cè)小檗堿對(duì) SGC7901 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用小檗堿對(duì) SGC7901 細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖 2-2 可顯示出，在劃痕 24 h 后，空白對(duì)照組細(xì)胞小，甚至是接近愈合的狀態(tài)，而小檗堿加藥組比對(duì)照組細(xì)胞缺度增大，缺口愈合情況越差。其中，20μM、40μM 的小檗堿作用的相對(duì)遷移率分別為 58.7 ± 4.80%、52.9 ± 4.25% (圖 2-2, P < 0夠顯著抑制 SGC7901 細(xì)胞的遷移力。Transwell 實(shí)驗(yàn)可表示，孵育 SGC7901 細(xì)胞 24 h 后，穿過(guò) Transwell 小室基底膜并明的細(xì)胞減少，即細(xì)胞侵襲能力有了明顯性的降低。通過(guò)與對(duì)照異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且呈濃度依賴性。其中 20μM、40μM 的小胞24h 的相對(duì)侵襲率分別為62.3 ± 0.19% 、59.6 ± 0.64% (圖2堿能夠顯著抑制 SGC7901 細(xì)胞的侵襲能力。

【參考文獻(xiàn)】

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3 錢平;楊秀偉;;左金方的化學(xué)成分、抗腫瘤作用及體內(nèi)過(guò)程研究進(jìn)展[J];中國(guó)現(xiàn)代中藥;2015年02期

4 胡麗娟;;加味左金丸對(duì)大腸癌裸鼠ERK/MAPK信號(hào)通路的干預(yù)作用[J];新中醫(yī);2015年02期

5 張仁霞;傅永錦;梁基智;潘競(jìng)鏘;;小檗堿治療大鼠免疫復(fù)合性潰瘍性結(jié)腸炎及下調(diào)炎性細(xì)胞因子作用[J];臨床醫(yī)學(xué)工程;2014年11期

6 辛靈艷;范理宏;;黃連素對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響[J];現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué);2014年05期

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8 丁世蘭;崔元璐;張葉;王強(qiáng)松;董天驕;;切換波長(zhǎng)HPLC同時(shí)測(cè)定左金丸乙醇提取物中7種生物堿的含量[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2012年15期

9 湯慶豐;劉宣;葛艷;周寧;周利紅;孫健;季青;高虹;李琦;;左金丸醇提物抑制幽門螺旋桿菌感染人胃癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年15期

10 沈克平;王海永;胡兵;劉威;;胃腸安對(duì)SGC-7901胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因表達(dá)影響[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2012年04期

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本文編號(hào)：2791527