【摘要】：目的:桔梗(Platvcodon grandiflorus,PG)是傳統(tǒng)的朝藥,具有很好的宣肺作用,桔梗皂苷D(PlarvcodinD PD)為桔梗的主要皂苷成分。本研究結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),建立以Raw264.7細(xì)胞上清液處理的A549細(xì)胞和香煙煙霧方法飼養(yǎng)的小鼠為研究對象的肺纖維化模型,探究桔梗提取物(PG Extract)和桔梗皂苷D對肺纖維化的調(diào)控作用及其潛在分子機(jī)制。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)選用BALB/c雄性小鼠,通過每日暴露于香煙煙霧3h、持續(xù)飼養(yǎng)11周建立肺纖維化模型,給藥組每天灌胃低中高劑量的桔梗提取物(100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg)和桔梗阜苷 D(20mg/kg)。造模結(jié)束后,對肺臟進(jìn)行石蠟切片、冷凍切片,通過HE染色、Masson染色、Sirius red染色、免疫組織化學(xué)染色和免疫組織熒光染色來觀察小鼠肺組織的病理學(xué)改變;提取小鼠肺組織的總蛋白、RNA進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)和RT-PCR實(shí)驗(yàn),測定α-平滑肌細(xì)胞肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Toll 樣受體-4(toll like receptor-4,TLR4)、嘌吟能離子通道型 7 受體(Purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor,P2X7r)、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)式受體 3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等蛋白和mRNA的表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)選用人肺癌細(xì)胞A549,收集脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)1μg/mL刺激Raw264.7細(xì)胞4h后的上清液,孵育A549細(xì)胞24h后,分別給予桔梗提取物(1O0μg/mL)和桔梗皂苷D(5μM)處理30min,提取細(xì)胞總蛋白和RNA進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)以及RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β等指標(biāo)的蛋白及mRNA的表達(dá)水平。進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色,觀察桔梗提取物和桔梗皂苷D對炎性上清液孵育A549細(xì)胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3炎性小體在細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,HE、Masson等染色結(jié)果,表明香煙煙霧組小鼠肺組織肺泡壁明顯增厚且伴有間質(zhì)水腫和膠原纖維沉積等現(xiàn)象,桔梗提取物和桔梗皂苷D組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對完整,且改善了間質(zhì)水腫以及減少了膠原纖維沉積的現(xiàn)象;給予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制香煙模型小鼠中α-SMA、I型膠原蛋白(collagen type I,collagen-I)的表達(dá)、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等蛋白以及mRNA的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中,Raw264.7細(xì)胞上清液刺激可引起A549細(xì)胞中 α-SMA、Collagen-I 的表達(dá)升高,以及 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指標(biāo)的表達(dá)升高,給予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制由Raw264.7細(xì)胞上清液刺激引起的 α-SMA、Collagen-I 的表達(dá)、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指標(biāo)的表達(dá)。結(jié)論:桔梗提取物和桔梗皂苷D可下調(diào)α-SMA、Collagen-Ⅰ的表達(dá)改善香煙煙霧誘發(fā)小鼠肺損傷、肺纖維化,改善炎性上清(LPS刺激Raw264.7上清液)孵育A549細(xì)胞中的炎癥因子釋放來達(dá)到一定的肺臟保護(hù)作用。P2X7r可能是桔梗提取物和桔梗皂苷D治療肺纖維化炎性反應(yīng)的核心靶點(diǎn),桔梗提取物和桔梗皂苷D可能通過介導(dǎo)P2X7r-NLRP3信號通路調(diào)控肺纖維化的發(fā)展進(jìn)程;通過抑制TLR4信號通路,從而減輕由香煙煙霧或炎性上清刺激引起的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

ａｐｉｏｓｙｌ逡逑圖２－１桔梗皂苷Ｄ化學(xué)結(jié)構(gòu)式逡逑２．２．３動物培養(yǎng)逡逑選用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，體重１８？２０ｇ，購于吉林省長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技逡逑術(shù)有限責(zé)任公司。在延邊大學(xué)科技樓動物室內(nèi)詞養(yǎng)，溫度為１８？２２°Ｃ，采用獨(dú)立逡逑通氣送風(fēng)系統(tǒng)，給予小鼠自由飲水和飲食。適應(yīng)一周后，開始造模。逡逑將小鼠隨機(jī)分為正常組、ＣＳ組、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ組、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ組，每天給予香煙煙霧前一個(gè)小時(shí)，開始逡逑對給藥組小鼠根據(jù)體重進(jìn)行灌胃，正常組用生理鹽水進(jìn)行灌胃（流程圖如逡逑下）。灌胃后一小時(shí)，將除了正常組和給予ＰＤ組的小鼠放在一個(gè)不完全封閉的逡逑透明箱中，點(diǎn)燃五只香煙（遵義香煙，購于超市里）放入透明箱中，讓香煙燒夠逡逑１５ｍｉｎ后，打開蓋子讓小鼠休息５ｍｉｎ，適當(dāng)休息后，繼續(xù)給予香煙煙霧，每天逡逑

ＯＨ邋0Ｈ逡逑ａｐｉｏｓｙｌ逡逑圖２－１桔梗皂苷Ｄ化學(xué)結(jié)構(gòu)式逡逑２．２．３動物培養(yǎng)逡逑選用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，體重１８？２０ｇ，購于吉林省長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技逡逑術(shù)有限責(zé)任公司。在延邊大學(xué)科技樓動物室內(nèi)詞養(yǎng)，溫度為１８？２２°Ｃ，采用獨(dú)立逡逑通氣送風(fēng)系統(tǒng)，給予小鼠自由飲水和飲食。適應(yīng)一周后，開始造模。逡逑將小鼠隨機(jī)分為正常組、ＣＳ組、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ組、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ組，每天給予香煙煙霧前一個(gè)小時(shí)，開始逡逑對給藥組小鼠根據(jù)體重進(jìn)行灌胃，正常組用生理鹽水進(jìn)行灌胃（流程圖如逡逑下）。灌胃后一小時(shí)，將除了正常組和給予ＰＤ組的小鼠放在一個(gè)不完全封閉的逡逑透明箱中，點(diǎn)燃五只香煙（遵義香煙，購于超市里）放入透明箱中，讓香煙燒夠逡逑１５ｍｉｎ后

延邊大學(xué)碩士學(xué)位論文邐梧梗介導(dǎo)Ｐ２Ｘ７ｒ－ＮＬＲＰ３信號通路調(diào)控肺纖維化作用機(jī)制的研宄逡逑第三章實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑３．１桔梗對Ａ５４９細(xì)胞存活率的影響逡逑我們通過ＭＴＴ實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度下的桔梗提取物和桔梗皂苷Ｄ對Ａ５４９細(xì)逡逑胞存活率的影響。如圖１所示，圖Ａ和圖Ｂ顯示，桔梗提取物（０？１２５ｐｇ／ｍＬ）、逡逑}P梗皂苷Ｄ邋（邋０？５ｊｉＭ邋）對Ａ５４９細(xì)胞存活率無影響，但桔梗提取物逡逑（２５０？２００0ｎｇ／ｍＬ）、桔梗皂苷Ｄ（邋１０ｐＭ）顯著抑制了邋Ａ５４９細(xì)胞存活率（Ｐ＜０．００７邋）。逡逑因此，選擇桔梗提取物（１００［ｉｇ／ｍＬ）和桔梗皂苷Ｄ邋（５｜ｉＭ）進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 彭曠;P2X7R在動脈粥樣硬化中對NLRP3炎癥小體的調(diào)節(jié)作用[D];大連醫(yī)科大學(xué);2014年

本文編號：2791335