【摘要】：目的:桔梗(Platvcodon grandiflorus,PG)是傳統(tǒng)的朝藥,具有很好的宣肺作用,桔梗皂苷D(PlarvcodinD PD)為桔梗的主要皂苷成分。本研究結合體內外實驗,建立以Raw264.7細胞上清液處理的A549細胞和香煙煙霧方法飼養(yǎng)的小鼠為研究對象的肺纖維化模型,探究桔梗提取物(PG Extract)和桔梗皂苷D對肺纖維化的調控作用及其潛在分子機制。方法:體內實驗選用BALB/c雄性小鼠,通過每日暴露于香煙煙霧3h、持續(xù)飼養(yǎng)11周建立肺纖維化模型,給藥組每天灌胃低中高劑量的桔梗提取物(100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg)和桔梗阜苷 D(20mg/kg)。造模結束后,對肺臟進行石蠟切片、冷凍切片,通過HE染色、Masson染色、Sirius red染色、免疫組織化學染色和免疫組織熒光染色來觀察小鼠肺組織的病理學改變;提取小鼠肺組織的總蛋白、RNA進行蛋白印跡實驗和RT-PCR實驗,測定α-平滑肌細胞肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Toll 樣受體-4(toll like receptor-4,TLR4)、嘌吟能離子通道型 7 受體(Purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor,P2X7r)、核苷酸結合寡聚化結構式受體 3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)、白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)等蛋白和mRNA的表達水平。體外實驗選用人肺癌細胞A549,收集脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)1μg/mL刺激Raw264.7細胞4h后的上清液,孵育A549細胞24h后,分別給予桔梗提取物(1O0μg/mL)和桔梗皂苷D(5μM)處理30min,提取細胞總蛋白和RNA進行蛋白印跡實驗以及RT-PCR實驗,檢測TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β等指標的蛋白及mRNA的表達水平。進行細胞免疫熒光染色,觀察桔梗提取物和桔梗皂苷D對炎性上清液孵育A549細胞中α-SMA、P2X7r、NLRP3炎性小體在細胞中的表達情況。結果:體內實驗中,HE、Masson等染色結果,表明香煙煙霧組小鼠肺組織肺泡壁明顯增厚且伴有間質水腫和膠原纖維沉積等現(xiàn)象,桔梗提取物和桔梗皂苷D組小鼠肺泡結構相對完整,且改善了間質水腫以及減少了膠原纖維沉積的現(xiàn)象;給予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制香煙模型小鼠中α-SMA、I型膠原蛋白(collagen type I,collagen-I)的表達、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等蛋白以及mRNA的表達。體外實驗中,Raw264.7細胞上清液刺激可引起A549細胞中 α-SMA、Collagen-I 的表達升高,以及 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指標的表達升高,給予桔梗提取物和桔梗皂苷D能抑制由Raw264.7細胞上清液刺激引起的 α-SMA、Collagen-I 的表達、抑制 TLR4、P2X7r、NLRP3、IL-1β 等指標的表達。結論:桔梗提取物和桔梗皂苷D可下調α-SMA、Collagen-Ⅰ的表達改善香煙煙霧誘發(fā)小鼠肺損傷、肺纖維化,改善炎性上清(LPS刺激Raw264.7上清液)孵育A549細胞中的炎癥因子釋放來達到一定的肺臟保護作用。P2X7r可能是桔梗提取物和桔梗皂苷D治療肺纖維化炎性反應的核心靶點,桔梗提取物和桔梗皂苷D可能通過介導P2X7r-NLRP3信號通路調控肺纖維化的發(fā)展進程;通過抑制TLR4信號通路,從而減輕由香煙煙霧或炎性上清刺激引起的炎癥反應。
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

ａｐｉｏｓｙｌ逡逑圖２－１桔梗皂苷Ｄ化學結構式逡逑２．２．３動物培養(yǎng)逡逑選用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，體重１８？２０ｇ，購于吉林省長春市億斯實驗動物技逡逑術有限責任公司。在延邊大學科技樓動物室內詞養(yǎng)，溫度為１８？２２°Ｃ，采用獨立逡逑通氣送風系統(tǒng)，給予小鼠自由飲水和飲食。適應一周后，開始造模。逡逑將小鼠隨機分為正常組、ＣＳ組、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ組、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ組，每天給予香煙煙霧前一個小時，開始逡逑對給藥組小鼠根據體重進行灌胃，正常組用生理鹽水進行灌胃（流程圖如逡逑下）。灌胃后一小時，將除了正常組和給予ＰＤ組的小鼠放在一個不完全封閉的逡逑透明箱中，點燃五只香煙（遵義香煙，購于超市里）放入透明箱中，讓香煙燒夠逡逑１５ｍｉｎ后，打開蓋子讓小鼠休息５ｍｉｎ，適當休息后，繼續(xù)給予香煙煙霧，每天逡逑

ＯＨ邋0Ｈ逡逑ａｐｉｏｓｙｌ逡逑圖２－１桔梗皂苷Ｄ化學結構式逡逑２．２．３動物培養(yǎng)逡逑選用ＢＡＬＢ／ｃ雄性小鼠，體重１８？２０ｇ，購于吉林省長春市億斯實驗動物技逡逑術有限責任公司。在延邊大學科技樓動物室內詞養(yǎng)，溫度為１８？２２°Ｃ，采用獨立逡逑通氣送風系統(tǒng)，給予小鼠自由飲水和飲食。適應一周后，開始造模。逡逑將小鼠隨機分為正常組、ＣＳ組、ＣＳ＋ＰＧ－１００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＧ－２００ｍｇ／ｋｇ組、逡逑ＣＳ＋ＰＧ－３００ｍｇ／ｋｇ組、ＣＳ＋ＰＤ－２０ｍｇ／ｋｇ組，每天給予香煙煙霧前一個小時，開始逡逑對給藥組小鼠根據體重進行灌胃，正常組用生理鹽水進行灌胃（流程圖如逡逑下）。灌胃后一小時，將除了正常組和給予ＰＤ組的小鼠放在一個不完全封閉的逡逑透明箱中，點燃五只香煙（遵義香煙，購于超市里）放入透明箱中，讓香煙燒夠逡逑１５ｍｉｎ后

延邊大學碩士學位論文邐梧梗介導Ｐ２Ｘ７ｒ－ＮＬＲＰ３信號通路調控肺纖維化作用機制的研宄逡逑第三章實驗結果逡逑３．１桔梗對Ａ５４９細胞存活率的影響逡逑我們通過ＭＴＴ實驗觀察不同濃度下的桔梗提取物和桔梗皂苷Ｄ對Ａ５４９細逡逑胞存活率的影響。如圖１所示，圖Ａ和圖Ｂ顯示，桔梗提取物（０？１２５ｐｇ／ｍＬ）、逡逑}P梗皂苷Ｄ邋（邋０？５ｊｉＭ邋）對Ａ５４９細胞存活率無影響，但桔梗提取物逡逑（２５０？２００0ｎｇ／ｍＬ）、桔梗皂苷Ｄ（邋１０ｐＭ）顯著抑制了邋Ａ５４９細胞存活率（Ｐ＜０．００７邋）。逡逑因此，選擇桔梗提取物（１００［ｉｇ／ｍＬ）和桔梗皂苷Ｄ邋（５｜ｉＭ）進行后續(xù)實驗。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑

【參考文獻】

相關博士學位論文 前1條

1 彭曠;P2X7R在動脈粥樣硬化中對NLRP3炎癥小體的調節(jié)作用[D];大連醫(yī)科大學;2014年

本文編號：2791335