【摘要】：目的:本課題通過觀察體內(nèi)實驗中空腹血糖(FPG)、膽固醇(TC)、脂肪酸(TG)、游離脂肪酸(FFA)、心肌FABP3蛋白表達量、心肌ATP含量、左心室射血分數(shù)(EF%)、心肌形態(tài)觀察及FABP3蛋白表達量、ATP含量與EF%相關性,進一步探討益糖康對2型糖尿病大鼠心肌FABP3含量及基因表達方面的影響,并試圖揭示其相關性。再通過檢測體外實驗中H9C2心肌細胞中ATP含量、呼吸鏈復合物(Ⅰ、Ⅱ)、心肌收縮相關蛋白表達量、脂肪酸代謝相關蛋白表達量,以觀察益糖康是否通過調(diào)控FABP3表達介導線粒體途徑影響心肌收縮相關蛋白從而改善心肌收縮能力,由此完成其機制研究。材料與方法:論文一:SPF級健康雄性Westar大鼠,體重200±20g,2月齡,50只。使用隨機數(shù)字表法分為5組,分別為正常對照組(10只),模型對照組(10只),高劑量組(10只),中劑量組(10只),低劑量組(10只)。對模型對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組進行高脂喂養(yǎng)4周后予鏈脲佐菌素(STZ)45mg/kg腹腔注射造模復制。隨機抽取4個造模組大鼠各一只檢測血糖超過16.7mmol/L則為造模成功。模型對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組造模成功后,給予正常對照組和模型對照組大鼠生理鹽水灌胃,高、中、低組給予不同劑量的中藥益糖康水煎液灌胃(中藥制劑水煎液濃度為100%,裝瓶備用,于4℃冷藏保存)。以益糖康臨床使用劑量為中劑量,2倍為高劑量,1/2為低劑量。上述方法,每天一次,為期4周。給藥劑量根據(jù)人與生物生藥換算公式計算。使用益糖康作為干預因素進行實驗干預后2周、4周分別進行空腹血糖檢測。治療結(jié)束后,稱取體重、取材血清、心肌組織,檢測大鼠的空腹血糖(FPG)、膽固醇(TC)、脂肪酸(TG)含量、血清心肌酶譜與游離脂肪酸(FFA)、超聲心肌收縮及舒張功能、心肌形態(tài)、心肌FABP3的表達、心肌中ATP含量,并采用偏相關分析方法分析FABP3蛋白表達、ATP含量與EF%的相關性。其中空腹血糖(FPG)、膽固醇(TC)、脂肪酸(TG)含量采用全自動生化分析儀檢測,游離脂肪酸(FFA)使用Elisa試劑盒檢測,心肌FABP3蛋白的表達采用Western-blot方法檢測,心肌中ATP含量采用比色法檢測,左心室收縮功能使用小動物超聲檢測,心肌形態(tài)使用HE染色法光鏡下觀察,FABP3蛋白表達、ATP含量與EF%的相關性使用SPSS軟件偏相關分析法分析。論文二:本實驗采用SPF級Wistar雄性大鼠60只,體重(200±20)g,2月齡,60只以及H9c2細胞作為實驗研究對象。采用隨機數(shù)字表法將60只符合試驗標準的大鼠隨機分為2組,空白對照組30只,益糖康組30只,各組雌雄各半。按每kg體重大鼠的給藥量為人的6.3倍計算,并且每次大鼠給藥量為2倍體積正常人入藥量,且日2次,空白對照組用蒸餾水灌服,于第4d晨起給大鼠灌胃2h后,予大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉,采用腹主動脈取血,室內(nèi)靜置2 h后,離心(2500 r/min,4℃,20 min),然后收集血清,56℃水浴滅活30 min,經(jīng)分裝后,-81℃保存。H9C2細胞采用DMEM培養(yǎng)基,含有10 mM葡萄糖,10%FBS,1%青鏈霉素,于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育。含有可變長度的FABP3啟動子質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再予以含益糖康血清干預。通過比色法檢測ATP含量、呼吸鏈復合物(Ⅰ、Ⅱ),Western-blot檢測心肌細胞心肌收縮相關蛋白(SERCA、RYR2、PLB),Western-blot檢測脂肪酸氧化相關蛋白(CPT-1、CPT-2)。結(jié)果:論文一:1.高脂飲食喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素腹腔注射方法制備2型糖尿病大鼠模型后,測定各造模組大鼠的生理指標�？崭寡�:各造模組大鼠共有75%空腹血糖16.8mmol/L(可以保證每組至少10大鼠繼續(xù)進行實驗),與正常對照組比較,各組大鼠空腹血糖均顯著升高(P0.01);模型對照組,高、中、低組之間沒有顯著差異(P0.05)。體重情況:造模后,與正常對照組比較,各造模組大鼠體重均顯著升高(P0.01);模型對照組,高、中、低組之間沒有顯著差異(P0.05)。一般情況:各造模組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿癥狀。2.使用益糖康為干預因素,進行實驗干預,在干預2周、4周時檢測各組大鼠體重和空腹血糖,發(fā)現(xiàn)與正常對照組比較,各組大鼠體重均顯著低于正常對照組(P0.05或P0.01);與模型對照組比較,高、中劑量組顯著升高(P0.05),三個劑量組之間沒有顯著差異(P0.05)。干預4周后,與正常對照組比較,各組大鼠體重均顯著低于正常對照組(P0.01);與模型對照組比較,三個劑量組均顯著升高(P0.01),三個劑量組之間沒有顯著差異(P0.05)。而空腹血糖水平則表現(xiàn)為,與正常對照組比較,各組大鼠空腹血糖均顯著升高(P0.05或P0.01);與模型對照組比較,高劑量組空腹血糖顯著降低(P0.05),中、低劑量組沒有顯著差異(P0.05);三個劑量組之間沒有顯著差異(P0.05)。干預4周后,與正常對照組比較,各組大鼠空腹血糖均顯著高升高(P0.05或P0.01);與模型對照組比較,高、中劑量組空腹血糖顯著降低(P0.01),低劑量組沒有顯著差異(P0.05);低劑量組顯著高于高、中劑量組(P0.01)。3.實驗結(jié)束后檢測大鼠血液中TC、TG、FFA情況顯示,與正常對照組比較,各組大鼠TC和TG均顯著升高(P0.01);與模型組比較,三個劑量組TC和TG均顯著降低(P0.01);三個劑量組之間比較,高劑量組降低最顯著(P0.05或P0.01)。4.實驗結(jié)束后心功能檢測顯示,造模組大鼠射血分數(shù)顯著下降。與正常對照組相比,模型對照組大鼠心肌ATP含量下降(p0.01);低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌ATP含量較模型對照組顯著升高(p0.01)。5.試驗結(jié)束后檢測各組大鼠心肌FABP3蛋白含量顯示,模型對照組大鼠心肌FABP3的蛋白表達量及m RNA水平均顯著上升(P0.01)。低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠心肌FABP3的蛋白表達量及mRNA水平較模型對照組下降且與益糖康劑量呈負相關,提示糖尿病心肌組織中,FABP3的表達增加,經(jīng)益糖康治療后FABP3表達下降,且隨著劑量加大對FABP3表達抑制越發(fā)明顯。6.控制FABP3蛋白表達時,ATP含量與EF%偏相關系數(shù)=0.791,P0.01,則可以認為ATP含量與EF%之間存在線性關系,屬于正相關�？刂艫TP含量時,FABP3蛋白表達與EF%偏相關系數(shù)=-0.693,P0.01,則可以認為FABP3蛋白表達與EF%之間存在線性關系,屬負相關。論文二:1.對比高、中、低劑量的益糖康含藥血清制備效果顯示,應使用高劑量益糖康制備含藥血清進行后續(xù)實驗。2.含有可變長度的FABP3啟動子質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再予以含益糖康血清干預后,比色法檢測H9c2細胞ATP結(jié)果顯示,與正常對照組相比,FABP3過表達組心肌細胞中的ATP含量明顯減少(P0.01),含藥血清組心肌細胞中的ATP含量有所減少(P0.05);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的ATP含量則有明顯提高(P0.01)。3.含可變長度的FABP3啟動子質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再予以含益糖康血清干預后,比色法檢測H9c2細胞呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ結(jié)果顯示,與正常對照組相比,FABP3過表達組心肌細胞中呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ含量明顯減少(P0.01),而含藥血清組心肌細胞中呼吸鏈復合物Ⅰ含量明顯減少(P0.01),呼吸鏈復合物Ⅱ有所減少(P0.05);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中呼吸鏈復合物Ⅰ含量明顯增加(P0.01),呼吸鏈復合物Ⅱ有所增加(P0.05)。4.含可變長度的FABP3啟動子質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再予以含益糖康血清干預后,Western-blot檢測心肌細胞心肌收縮相關蛋白(SERCA、RYR2、PLB)含量結(jié)果顯示,與正常對照組相比,FABP3過表達組和含藥血清組心肌細胞中的SERCA含量明顯減少(P0.01);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的SERCA含量則有明顯提高(P0.01)。與正常對照組相比,FABP3過表達組和含藥血清組心肌細胞中的RYR2含量有所降低(P0.05);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的RYR2含量則有明顯升高(P0.01)。與正常對照組相比,FABP3過表達組和含藥血清組心肌細胞中的PLB含量明顯增加(P0.01);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的PLB含量則有明顯降低(P0.01)。5.含可變長度的FABP3啟動子質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)染后再予以含益糖康血清干預后,Western-blot檢測心肌細胞脂肪酸氧化相關蛋白(CPT-1、CPT-2)含量結(jié)果顯示,與正常對照組相比,FABP3過表達組心肌細胞中的CPT-1含量明顯減少(P0.01),含藥血清組心肌細胞中的CPT-1含量有所降低(P0.05);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的CPT-1含量則有明顯升高(P0.01)。與正常對照組相比,FABP3過表達組和含藥血清組心肌細胞中的CPT-2含量明顯減少(P0.01);與FABP3過表達組比較,含藥血清組心肌細胞中的CPT-2含量則有明顯升高(P0.01)。結(jié)論:1.在體內(nèi)實驗中,高脂飲食喂養(yǎng)結(jié)合鏈脲佐菌素腹腔注射方法可以有效制備2型糖尿病大鼠模型,減輕模型大鼠體重,提高模型大鼠空腹血糖水平,使之出現(xiàn)三多一少癥狀,且在本實驗中顯示出成功率為75%。益糖康可以有效降低2型糖尿病大鼠空腹血糖水平,有效減緩2型糖尿病大鼠體重減少的程度,有效降低2型糖尿病大鼠血清TC、TG、FFA水平,明顯提高心肌組織中的ATP含量、有效抑制FABP3表達以提高心肌收縮能力。2型糖尿病大鼠心肌FABP3蛋白表達與心臟射血分數(shù)呈負相關;ATP與心臟射血分數(shù)呈正相關。2.在體外實驗中,高劑量益糖康含藥血清可明顯提高FABP3過表達的心肌細胞中ATP含量,明顯提高FABP3過表達的心肌細胞中線粒體中的呼吸鏈復合物Ⅰ、Ⅱ含量,提示益糖康可以通過對復合物Ⅰ、Ⅱ轉(zhuǎn)運電子行為具有促進作用,明顯提高FABP3過表達的心肌細胞中心肌收縮相關蛋白SERCA、RYR2、PLB的活性含量,明顯提高FABP3過表達的心肌細胞中CPT1、CPT2蛋白活性含量。這提示益糖康可以通過改善心肌細胞脂代謝相關蛋白,改善心肌細胞中ATP生成環(huán)境,提高ATP生成水平,從而改善心肌細胞的收縮能力。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：
圖 1-1 各組大鼠體重柱形圖糖尿病模型大鼠空腹血糖的影響明，干預前，與正常對照組比較，各組大鼠空腹血糖均顯著升高，高、中、低組之間沒有顯著差異（P>0.05）。干預 2 周后，與大鼠空腹血糖均顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；與模型對照組糖顯著降低（P＜0.05），中、低劑量組沒有顯著差異（P>0.05）顯著差異（P>0.05）。干預 4 周后，與正常對照組比較，各組大高（P＜0.05 或 P＜0.01）；與模型對照組比較，高、中劑量組空.01），低劑量組沒有顯著差異（P>0.05）；低劑量組顯著高于高。（見表 1-2，圖 1-2）表 1-2 大鼠空腹血糖情況（mmol/l， x s）例數(shù) 干預前 干預 2 周 干預 4 10 5.75±0.63 6.31±0.72 6.45±0
圖 1-2 各組大鼠空腹血糖柱形圖病模型大鼠血脂的影響通過益糖康干預，與正常對照組比較，各組大鼠 TC、；與模型對照組比較，三個劑量組 TC、TG 及 FFA 均顯著比較，高劑量組降低最顯著（P＜0.05 或 P＜0.01）。（見表 1-3 大鼠血脂情況（mg/dl， x s）例數(shù) TC TG 10 60.86±8.04 68.57±9.09 1810 179.19±14.62**194.06±18.93**64710 99.87±6.99**##106.56±11.72**##396.10 123.82±8.21**##▲▲139.33±10.94**##▲▲491.10 144.44±13.15**##▲157.98±15.56**###▲▲581.
圖 1-3 干預后大鼠血清 TC、TG 含量柱形圖尿病模型大鼠心肌形態(tài)的影響組肌細胞排列規(guī)則，細胞大小一致，包漿染色均勻。模型對胞間隙增大，細胞肌漿染色不均，較多細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡述情況有所改善，且高劑量組更加明顯。低劑量組肌細胞排不均，胞漿染色不甚均勻，少數(shù)細胞胞漿內(nèi)可見空泡。（見
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本文編號：2791566
