【摘要】：目的觀察楓蓼腸胃康顆粒對腹瀉型腸易激綜合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)的治療作用并從離體結(jié)腸平滑肌收縮及結(jié)腸黏膜氯離子分泌探討及其療效機(jī)制。方法本研究分為以下四個實驗:一、楓蓼腸胃康顆粒對IBS-D大鼠的治療作用;二、楓蓼腸胃康顆粒對正常大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮的影響及機(jī)制探討;三、楓蓼腸胃康顆粒對IBS-D大鼠結(jié)腸平滑肌肌條收縮的影響及機(jī)制探討;四、楓蓼腸胃康顆粒對IBS-D大鼠結(jié)腸粘膜氯離子分泌的影響及機(jī)制探討。具體方法如下:實驗一:1 日齡無特定病原體級(SpecificpathogenFree,SPF)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠隨機(jī)分為6組,包括正常組、模型組、楓蓼腸胃康高劑量組、楓蓼腸胃康中劑量組、楓蓼腸胃康低劑量組、陽性對照藥組(匹維溴銨組)。正常組不予任何處理,其余各組采用母嬰分離聯(lián)合束縛應(yīng)激方法建立IBS-D大鼠模型。60日齡造模結(jié)束并進(jìn)行模型評價。以糞便情況(糞便顆粒數(shù)、糞便含水量),內(nèi)臟敏感性(結(jié)直腸球囊擴(kuò)張刺激時腹外斜肌肌電曲線下面積比值(areaunderthecurve,AUC(%))的變化及腹壁撤退反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)評分變化)為模型評價指標(biāo)。造模成功后,各組大鼠給予相應(yīng)干預(yù)措施:楓蓼腸胃康高、中、低劑量組每天每100克大鼠體重分別給予楓蓼腸胃康生藥量0.47克、0.95克、1.89克;匹維溴銨組每天每100克大鼠體重給予2.1毫克匹維溴銨;各組均通過灌胃給藥的方式,藥物組每100克大鼠體重給藥1毫升,正常組和模型組給予等量的生理鹽水,連續(xù)灌胃14天。灌胃結(jié)束后,以糞便情況(糞便顆粒數(shù)、糞便含水量)和內(nèi)臟敏感性(AWR評分變化和AUC(%))評價楓蓼腸胃康顆粒對IBS-D模型大鼠的治療作用。實驗二:以SPF級雄性SD大鼠(體重:250-300g)制備正常大鼠離體縱行結(jié)腸平滑肌肌條(coloniclongitudinalsmoothmusclestrips,CLSMSs),以通有混合氣體(95%O2和5%C02)的Krebs液為CLSMSs的外營養(yǎng)液,以無輔料的楓蓼腸胃康干膏和Krebs液制備不同濃度的楓蓼腸胃康溶液,通過離體組織灌流系統(tǒng)進(jìn)行觀察對比:1.以生理鹽水作為對照,觀察楓蓼腸胃康對基礎(chǔ)狀態(tài)下CLSMSs收縮的影響;2.以生理鹽水作為對照,觀察楓蓼腸胃康對不同刺激引起CLSMSs收縮的影響。3.以自身前后作為對照,探討楓蓼腸胃康抑制乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的機(jī)制。實驗三:將1日齡SPF級SD雄性大鼠分為三組:模型組、正常組、楓蓼腸胃康組,參照實驗一的方法造模與給藥,灌胃結(jié)束后,制備各組大鼠的CLSMSs,并通過離體組織灌流系統(tǒng)研究對比:1.觀察楓蓼腸胃康對基礎(chǔ)狀態(tài)下CLSMSs收縮的影響;2.觀察楓蓼腸胃康對乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的影響;3.楓蓼腸胃康抑制乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的機(jī)制探討。實驗四:參照實驗三中的分組、造模與給藥方法,制備剝除粘膜下層、肌層和漿膜層后的離體結(jié)腸粘膜標(biāo)本,并通過體外短路電流技術(shù)觀察對比:1.觀察楓蓼腸胃康對基礎(chǔ)狀態(tài)下跨上皮電壓、短路電流及跨上皮電阻的影響;2.觀察楓蓼腸胃康對毛喉素引起短路電流的變化(short-circuit current,AIsc)的影響;3.氯離子離子替代后觀察楓蓼腸胃康對毛喉素引起AIsc的影響;4.楓蓼腸胃康抑制結(jié)腸黏膜氯離子分泌的機(jī)制探討。結(jié)果實驗一:1.IBS-D大鼠模型評價:(1)排便頻率和糞便含水量增加:母嬰分離結(jié)合束縛應(yīng)激結(jié)束后,與正常組大鼠相比,模型組大鼠糞便顆粒數(shù)增多(P0.01)、糞便含水量增高(P0.01);(2)內(nèi)臟敏感性增高:AUC(%)及AWR評分高于正常組(結(jié)直腸內(nèi)球囊壓力在40、60毫米汞柱時(P0.01)、80毫米汞柱時(P0.05))。2.楓蓼腸胃康顆粒對IBS-D模型大鼠的治療作用:(1)改善糞便情況:①降低糞便含水量:與模型組比較,楓蓼腸胃康高劑量組、中劑量組糞便含水量均降低(P0.01)。②減少排便頻率:與模型組比較,楓蓼腸胃康中劑量組的糞便顆粒數(shù)減少(P0.05)。(2)改善內(nèi)臟高敏感性:①降低AUR(%):與模型組相比,楓蓼腸胃康高、中劑量組AUR(%)均降低(在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力為40、80 mmHg時楓蓼腸胃康高、中劑量組(P0.01);在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力為60mmHg時楓蓼腸胃康高劑量組(P0.01),中劑量組(P0.05))。②降低AWR評分:與模型組相比,楓蓼腸胃康高、中劑量組AWR評分均降低(在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力為40、60、80 mmHg時(P0.05))。實驗二:1.楓蓼腸胃康可抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下CLSMSs收縮:與對照組相比,從楓蓼腸胃康累計加藥濃度達(dá)到30 μg/ml開始,CLSMSs收縮的基礎(chǔ)相對張力和振幅呈劑量依賴性降低。(1)基礎(chǔ)相對張力:當(dāng)楓蓼腸胃康累計加藥濃度達(dá)到1000、3000 μg/ml時(P0.05),10000 μg/ml時(P0.01)。(2)基礎(chǔ)相對振幅:當(dāng)楓蓼腸胃康累計加藥濃度達(dá)到1000 μg/ml及以上時(P0.01)。2.楓蓼腸胃康可抑制不同刺激引起的CLSMSs收縮:與對照相比,從楓蓼腸胃康累計加藥濃度達(dá)到100 μg/ml開始,不同刺激引起的CLSMSs收縮呈劑量依賴性降低:(1)乙酰膽堿(0.1mmol/L):當(dāng)其累計加藥濃度達(dá)到1000 μg/ml時(P0.05),3000、10000μg/ml 時(P0.01);(2)氯化鉀(20mmol/L):當(dāng)其累計加藥濃度達(dá)到1000μg/ml及以上時(P0.05)。(3)胞內(nèi)鈣庫耗竭后胞外鈣離子內(nèi)流:當(dāng)其累計加藥濃度達(dá)到1000 μg/ml及以上時,(P0.01)。3.楓蓼腸胃康對乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的抑制作用可被抑制劑部分阻滯:(1)鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑(methylene blue,MB,10 μmol/L):當(dāng)楓蓼腸胃康累計加藥濃度達(dá)到300 μg/ml以上時,乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的相對振幅仍呈劑量依賴性降低,但高于對照(當(dāng)其累計加藥至1000 μg/ml及以上時(P0.05))(2)一氧化氮合酶抑制劑(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME,100 μmol/L):當(dāng)楓蓼腸胃康累加加藥濃度達(dá)到1000μg/ml以上時,肌條收縮振幅仍呈劑量依賴性降低,但高于對照(當(dāng)其累加加藥濃度達(dá)到 1000 μg/ml 時(P0.05),3000、10000 μg/ml 時(P0.01));(3)電壓依賴性鉀離子通道阻滯劑(4-aminopyridine,4-AP,50 μmol/L):從楓蓼腸胃康累積加藥濃度達(dá)到3 μg/ml開始,肌條收縮振幅雖呈劑量依賴性降低,但高于對照(當(dāng)其累積加藥濃度達(dá)到 1000 μg/ml 時(P0.01),3000、100000μg/ml 時(P0.05))。實驗三:1.楓蓼腸胃康可抑制基礎(chǔ)狀態(tài)下CLSMSs收縮:與模型組比較,楓蓼腸胃康組基礎(chǔ)平均張力下降(P0.01)。2.楓蓼腸胃康可抑制乙酰膽堿引起的CLSMSs收縮:與模型組比較,楓蓼腸胃康組由乙酰膽堿引起的收縮平均張力下降(P0.05)。3.楓蓼腸胃康對乙酰膽堿引起CLSMSs收縮的抑制作用可被抑制劑部分阻滯:分別應(yīng)用L型鈣離子通道拮抗劑(nifedipine,10 μmol/L)、一氧化氮合酶抑制劑(L-NAME,100μmol/L)、胞內(nèi)鈣池拮抗I劑(3,4,5-trimethoxybenzoic acid 8-(diethylamino)octyl ester hydrochloride,TMB-8,20μmol/L)、電壓依賴性鉀通道阻斷劑(4-AP,50 μmol/L)、鳥苷酸環(huán)化酶抑制劑(MB,10μmol/L)孵育后,各組由乙酰膽堿引起的平均收縮張力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。實驗四:1.各組基礎(chǔ)狀態(tài)跨上皮電壓、基礎(chǔ)短路電流、跨上皮電阻差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),然而楓蓼腸胃康組有下降趨勢。2.楓蓼腸胃康抑制毛喉素引起的氯離子分泌:與模型組相比,楓蓼腸胃康組由毛喉素引起的AIsc降低(P0.05)。3.氯離子替代后,楓蓼腸胃康對毛喉素引起的氯離子分泌抑制作用可被部分阻滯:三組間由毛喉素引起的ΔIsc差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4.楓蓼腸胃康對毛喉素引起的氯離子分泌抑制作用可被抑制劑部分阻滯:分別應(yīng)用非選擇性氯離子通道阻滯劑(diphenylamine-2-carboxylate,DPC,1 mmol/L,頂膜側(cè))DPC、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(cysticfibrosis transmembrane conductance regulator,CTFR)抑制劑格列本脲(1 mmol/L,頂膜側(cè))、鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運體(Na-K-Cl cotransporter,NKCC)抑制劑布美他尼(100 mmol/L,基底膜側(cè))孵育后,三組間由毛喉素引起的ΔIsc差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.楓蓼腸胃康顆粒可以有效緩解IBS-D大鼠的腹瀉癥狀,改善其內(nèi)臟高敏感性;2.楓蓼腸胃康顆粒可濃度依賴性的抑制正常大鼠及IBS-D模型大鼠離體結(jié)腸平滑肌收縮,其解痙機(jī)制可能與阻滯鈣離子通道、一氧化氮-鳥苷酸環(huán)化酶-環(huán)鳥氨酸通路及電壓依賴性鉀離子通道有關(guān);3.楓蓼腸胃康顆粒可以抑制結(jié)腸粘膜上皮氯離子分泌,其止瀉機(jī)制可能與阻滯頂膜側(cè)氯離子通道(包括囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白)及基底膜側(cè)鈉鉀氯共轉(zhuǎn)運體有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

Ｆｅｃａｌ邋ｐｅｌｌｅｔ邋ｎｕｍｂｅｒ：糞便顆粒數(shù)（正常組無處理１小時，模型組束縛應(yīng)激１小的糞便顆粒數(shù)的平均值），以ｍｅａｎｓ土ＳＥ表示，ｎ＝８；邋Ｎｏｒｍａｌ：正常組；ＩＢＳ－Ｄ：常組相比，Ｍｐ＜０．０１。逡逑３．１．１．２邋ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠的糞便含水量變化逡逑模型組大鼠糞便含水量（３３．７０±１．４９％）高于正常組（１６．８２±１．５８％），統(tǒng)計學(xué)意義（＃Ｐ＜０．０１），提示ＩＢＳ？模型大鼠經(jīng)母嬰分離和束縛應(yīng)激造組相比大便性狀偏�。▓D２）。逡逑４０逡逑l:本逡逑一邋３0邋—逡逑Ｓ邋２５－逡逑Ｉ邋２０－逡逑

模型組大鼠糞便含水量（３３．７０±１．４９％）高于正常組（１６．８２±１．５８％），差異有高度逡逑統(tǒng)計學(xué)意義（＃Ｐ＜０．０１），提示ＩＢＳ？模型大鼠經(jīng)母嬰分離和束縛應(yīng)激造模后，與正常逡逑組相比大便性狀偏�。▓D２）。逡逑４０逡逑l:本逡逑一邋３0邋—逡逑Ｓ邋２５－逡逑Ｉ邋２０－逡逑５邐Ｔ邐極擺：逡逑Ｉ邋１０邋－逡逑■逡逑0邋Ｊ邐邐■邐邐＾邐■逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐ＩＢＳ－Ｄ逡逑圖２邋ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠的糞便含水量變化逡逑６２逡逑

高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)差異ＣＰ＜0．0５），說明ＩＢＳ－Ｄ模型大鼠對４0、６０、８0毫米逡逑汞柱的結(jié)直腸內(nèi)球囊壓力刺激反應(yīng)敏感，間接反應(yīng)出ＩＢＳ－Ｄ大鼠的結(jié)直腸痛閾降低、逡逑內(nèi)臟敏感性增高（圖３）。逡逑４邋￣ｊ逡逑□邋■邋Ｎｏｒｍａｌ逡逑３．５邋－邐＾邐ｆ逡逑＋邋ｍｓ－Ｄ逡逑３邋－邐林邋＾００＾＾逡逑丨Ｐ逡逑0邋５邋－邐ＣＲＤ邋（ｒｎｒｎＨｇ）逡逑０邋Ｈ邐１邐１邐１邐１邐１逡逑0邐２０邐４０邐６０邐８０邐１００逡逑圖３大鼠的腹壁回撤反射評分變化逡逑ＡＷＲ邋ｓｃｏｒｅ：腹壁回撤反射評分，以ｍｅａｎｓ士ＳＥ表示，ｎ＝８。Ｎｏｒｍａｌ：正常組；ＩＢＳ－Ｄ：模型逡逑組；ＣＲＤ：結(jié)直腸擴(kuò)張；ｍｍＨｇ：毫米

本文編號：2790471