【摘要】：肝癌是全世界最常見(jiàn)六大癌癥,也是癌癥中導(dǎo)致死亡的第二大原因,我國(guó)肝癌的發(fā)病率在世界水平上相對(duì)較高,對(duì)還在處于發(fā)展中的中國(guó)的醫(yī)療和社會(huì)保障產(chǎn)生了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。肝癌有著發(fā)現(xiàn)難,進(jìn)展快的特點(diǎn),目前還沒(méi)有標(biāo)志物能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出早期肝癌,通�；颊叽_診的時(shí)候已經(jīng)到達(dá)晚期,錯(cuò)過(guò)了最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)。目前治療肝癌的靶向性藥物的特異性都不高,并且針對(duì)單一靶點(diǎn)的靶向藥物連續(xù)用藥后容易產(chǎn)生耐藥性,仍然需要找到針對(duì)更多靶點(diǎn)的藥物增加肝癌治療效果,延長(zhǎng)患者的生存期,改善生活質(zhì)量。AMPK是一種與能量代謝相關(guān)的蛋白,當(dāng)細(xì)胞中ATP低于閾值后會(huì)激活A(yù)MPK,抑制ATP消耗,包括脂質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)的合成。腫瘤細(xì)胞是一種高增殖的細(xì)胞,會(huì)消耗大量的ATP用于合成各種物質(zhì),腫瘤組織中AMPK的表達(dá)會(huì)比腫瘤周?chē)M織明顯減低,提示AMPK是一種潛在的抗腫瘤靶點(diǎn)。中醫(yī)中藥是我國(guó)傳統(tǒng)智慧的產(chǎn)物,有將近幾千年的歷史證明其有效性,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)中藥的有效成分是一種重要的新藥來(lái)源,最新發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯除了有抗菌殺蟲(chóng)作用以外,還有抗腫瘤作用。因此本研究目的在于探索異土木香內(nèi)酯體內(nèi)外抗肝癌作用,是否通過(guò)AMPK信號(hào)通路產(chǎn)生作用,并且初步探索相關(guān)機(jī)制。本課題研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分。第一部分:異土木香內(nèi)酯的體外抗肝癌作用采用MTT檢測(cè)方法研究異土木香內(nèi)酯的體外抗肝癌效果,明確了其抗腫瘤的劑量和時(shí)間依賴性,并求出其IC_(50)。異土木香內(nèi)酯對(duì)Bel-7402 24 h、48 h和72 h的IC_(50)分別為37.4、25.46、22.36μM。HepG2則是34.82、26.32、20.22μM。第二部分:異土木香內(nèi)酯的體內(nèi)抗肝癌作用建立肝癌細(xì)胞Bel-7402的BALB/c荷瘤裸鼠模型。將異土木香內(nèi)酯制備脂質(zhì)體,每天灌胃給藥1次,連續(xù)用藥14天,隔天測(cè)量腫瘤體積和裸鼠重量,第15天處死動(dòng)物后取腫瘤組織稱重。90 mg·kg~(-1)異土木香內(nèi)酯的體積抑制率有67.32%,重量抑制率有70.15%,并且其體內(nèi)抗腫瘤作用具有一定的安全性。第三部分:異土木香內(nèi)酯抗腫瘤機(jī)制研究利用Hoechst 33258觀察異土木香內(nèi)酯對(duì)肝癌細(xì)胞的形態(tài)改變。使用Annexin V-FITC、PI、DCFH-DA染色配合流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡、周期抑制、ROS生成情況。結(jié)果顯示40μM異土木香內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)肝癌凋亡,將肝癌細(xì)胞增殖阻滯在G2/M期,同時(shí)可以顯著升高ROS水平。使用Western bolt和免疫組化檢測(cè)關(guān)鍵信號(hào)分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn),40μM異土木香內(nèi)酯可以誘導(dǎo)p-AMPK、p53、Bax和Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9的表達(dá)水平升高,同時(shí)可以抑制CyclinB1、CDK1和Bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的表達(dá)。免疫組化的結(jié)果顯示,腫瘤組織中的p-AMPK、p53和Caspase3蛋白質(zhì)表達(dá)也均會(huì)上調(diào)。綜上所述,異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)外均有抗肝癌作用。機(jī)制是通過(guò)產(chǎn)生ROS,激活A(yù)MPK通路,上調(diào)p53調(diào)控因子而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡,同時(shí)還能將肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期阻滯于G2/M期,通過(guò)多靶點(diǎn)的方式抑制肝癌增殖。本研究將為異土木香內(nèi)酯作為抗肝癌新藥的研發(fā)和臨床精準(zhǔn)化使用奠定理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

X 軸為濃度，，Y 軸為抑制率作出柱形圖，表上誤差線。利用 GraphPad prism6.0的分析功能，把 X 軸換算成 LogX，根據(jù)三次的增殖抑制率分析算出三個(gè)孵育時(shí)間的 IC50。2.5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT 實(shí)驗(yàn)證明，IAL 對(duì)肝癌 Bel-7402 和 HepG2 均有明顯的體外抑制作用，并且具有劑量依賴性和時(shí)間依賴性。經(jīng)過(guò) SPSS22.0 的 Levene 方差齊性檢驗(yàn)，顯示方差齊，F(xiàn) 檢驗(yàn)顯示各組之間有顯著差異（p<0.01）；使用 LSD 統(tǒng)計(jì)兩組之間差異，與空白組對(duì)比，大部分都有差異（見(jiàn)圖 2-1）。把不同濃度不同時(shí)間段的抑制率輸入 GraphPad prism6.0 計(jì)算，得出 IC50（見(jiàn)表 2-1）。在 24h 時(shí)間點(diǎn)上，20μM 以下濃度的 IAL 對(duì)于 HepG2 幾乎沒(méi)有抑制作用，濃度一旦到達(dá) 40μM 則抑制率增大至60%以上，可以認(rèn)為 HepG2 細(xì)胞有某個(gè)耐藥的閾值，而 IAL 對(duì) Bel-7402 則沒(méi)有這種現(xiàn)象，IC50也比 HepG2 高。根據(jù) MTT 的結(jié)果，兩種肝癌細(xì)胞在給藥 48h 后，40μM和 80μM 已經(jīng)超過(guò) 90%的抑制率，兩組之間差異不大，故認(rèn)為對(duì)于體外實(shí)驗(yàn)超過(guò)24 h 后 40 μM 即可使細(xì)胞進(jìn)入大量死亡狀態(tài)，高濃度藥效差異消失。

圖 3-1 荷瘤裸鼠體重變化趨勢(shì)（Mean SD，n=6）Fig.3-1 Weight changes of tumor-bearing nude mice（Mean SD，n=6）在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行期間，可以觀察到裸鼠的皮下腫瘤隨時(shí)間變大，觸摸腫瘤位置固定，手感結(jié)實(shí)。根據(jù)隔天度量的體積數(shù)據(jù)，以實(shí)驗(yàn)天數(shù)為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)作點(diǎn)線圖，標(biāo)出誤差線（見(jiàn)圖 3-2）。統(tǒng)計(jì)每天的體重?cái)?shù)據(jù)，經(jīng)過(guò) Levene 方差齊性檢驗(yàn)，顯示每天均方差齊。接著使用 F 檢驗(yàn)，第三天開(kāi)始各組間出現(xiàn)差異（p<0.05），第十一天開(kāi)始有明顯差異（p<0.01）。使用 LSD 在模型組與各組之間對(duì)比，直到第九天，5-FU 組和 IAL-H 組開(kāi)始出出現(xiàn)差異（p<0.05），隔天差異明顯（p<0.01）。IAL-M 組和 IAL-L 組也會(huì)出現(xiàn)差異，不過(guò)出現(xiàn)時(shí)間會(huì)相對(duì)推遲。在實(shí)驗(yàn)期間，脂質(zhì)體對(duì)照組始終與模型組沒(méi)有差異（p>0.05）。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 Yenan Feng;Youyi Zhang;Han Xiao;;AMPK and cardiac remodelling[J];Science China(Life Sciences);2018年01期

2 許夢(mèng)川;吳躍峰;李東明;;AMPK的功能調(diào)控及其與腫瘤之間的關(guān)系[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2018年01期

3 Jing Wang;Zhenyu Li;Li Gao;Yanshuang Qi;Haibo Zhu;Xuemei Qin;;The regulation effect of AMPK in immune related diseases[J];Science China(Life Sciences);2018年05期

4 趙偉;王耀光;王成盼;;運(yùn)動(dòng)改善AMPK的研究現(xiàn)狀[J];中國(guó)學(xué)校體育(高等教育);2018年02期

5 于辰曦;孫水;;AMPK在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用[J];生命的化學(xué);2016年06期

6 Zhao-Ying Liu;Shun-Peng Hu;Qing-Rong Ji;Hai-Bo Yang;Dong-Hao Zhou;Fang-Fang Wu;;Sevoflurane pretreatment inhibits the myocardial apoptosis caused by hypoxia reoxygenation through AMPK pathway:An experimental study[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年02期

7 方明珠;徐艷秋;;AMPK與肥胖相關(guān)性腎病[J];貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2016年06期

8 Jin Li;Liping Zhong;Fengzhong Wang;Haibo Zhu;;Dissecting the role of AMP-activated protein kinase in human diseases[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2017年03期

9 Suneng Fu;;From glucose sensing to a unified model of AMPK and m TOR regulation[J];Science Bulletin;2017年18期

10 趙力揮;王璐;劉文麗;王國(guó)成;;天然產(chǎn)物中的AMPK激活劑研究進(jìn)展[J];中草藥;2017年18期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 孫宏斌;;AMPK:new insights into an old molecule[A];第十四屆中國(guó)藥學(xué)會(huì)青年藥學(xué)論壇報(bào)告集[C];2018年

2 曹勛紅;徐平;廖尉廷;閆景瑤;羅宮薇;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;吳磊;鄒挺;;AMPK對(duì)胚胎成纖維細(xì)胞干細(xì)胞基因表達(dá)的影響[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)張錫鈞基金第十三屆全國(guó)青年優(yōu)秀生理學(xué)學(xué)術(shù)論文綜合摘要、中國(guó)生理學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)青年生理學(xué)工作者學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要[C];2015年

3 趙明華;余海燕;王蘊(yùn)紅;張雪琳;;運(yùn)動(dòng)前補(bǔ)糖對(duì)大鼠心肌AMPK激活的影響[A];第四屆（2016）全國(guó)運(yùn)動(dòng)生理與生物化學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議——運(yùn)動(dòng)·體質(zhì)·健康論文摘要匯編[C];2016年

4 陳蘇寧;Lai Xiaofeng;Zhang Jian;;Combined cancer therapy:all roads lead to AMPK[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床藥學(xué)分會(huì)2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年

5 李怡寧;胡濟(jì)安;;AMP-activated protein kinase (AMPK) protects necrosis via regulation of Keap1-PGAM5 complex[A];2015年浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2015年

6 楊敏;陳少賢;劉居理;劉曉穎;符永恒;張夢(mèng)珍;林秋雄;朱杰寧;麥麗萍;單志新;余細(xì)勇;林曙光;;三七總皂苷通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK抑制心肌細(xì)胞凋亡[A];第八屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2011年

7 Paul M Vanhoutte;;SIRT1 and AMPK:the Seesaw Effect in Regulating Endothelial Sene-scence[A];第八屆海峽兩岸心血管科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2011年

8 ;AMPK mediated an apoptotic response to combined effect of hypoxia stress and ER stress[A];2012全國(guó)發(fā)育生物學(xué)大會(huì)摘要集[C];2012年

9 ZHANG Jian-wei;MA Xiao-wei;DENG Rui-fen;DING Shan;GU Nan;GUO Xiao-hui;;Genetic variability in AMPKαl gene may have synergetic effect with smoking on risk of coronary artery disease in chinese type 2 diabetics[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)第十六次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2012年

10 Jia-Wei Wu;;Conserved elements in allosteric regulation of AMPK[A];中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)會(huì)第十一次會(huì)員代表大會(huì)暨2014年全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集——專題報(bào)告二[C];2014年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前5條

1 陳丹;激活一關(guān)鍵基因可延緩果蠅衰老進(jìn)程[N];科技日?qǐng)?bào);2014年

2 ;探索心中的奧秘[N];健康報(bào);2012年

3 實(shí)習(xí)生 程鳳;不愛(ài)鍛煉可能與基因缺失有關(guān)[N];科技日?qǐng)?bào);2011年

4 記者 李鵬;她在解構(gòu)蛋白“機(jī)器”[N];北京科技報(bào);2011年

5 記者 佘崢;降血糖“百年神藥”秘密被發(fā)現(xiàn)[N];廈門(mén)日?qǐng)?bào);2016年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 郭旭光;PavA通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR通路誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞自噬在肺炎鏈球菌感染中的作用機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

2 鐘娟;含笑內(nèi)酯富馬酸鹽激活PPAR-γ介導(dǎo)NF-κB和AMPK/mTOR通路對(duì)db/db鼠肝腎損害的保護(hù)作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

3 閆鵬;AMPK-SIRT1信號(hào)通路在脊髓損傷后神經(jīng)細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)中的作用[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

4 趙浩東;酒精上調(diào)CCL5表達(dá)通過(guò)激活A(yù)MPK通路誘導(dǎo)自噬促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2018年

5 孟一迪;Ca~(2+)/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ調(diào)節(jié)AMP激活蛋白激酶靶向調(diào)控缺血性心臟病脂肪酸代謝的機(jī)制研究[D];華中科技大學(xué);2017年

6 李政委;microRNA-135b表達(dá)沉默Ppm1e激活A(yù)MPK信號(hào)通路抑制人骨肉瘤細(xì)胞增殖[D];蘇州大學(xué);2018年

7 苗志強(qiáng);早期日糧能量水平調(diào)控肉仔雞小腸磷轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)理研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

8 宋海英;冬眠心肌AMPK/PGC-1α/PPARα/UCP2通路的作用及理氣活血中藥的干預(yù)效應(yīng)研究[D];中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院;2018年

9 田閣;AMPKα2基因缺乏對(duì)糖尿病心肌病運(yùn)動(dòng)干預(yù)的影響及機(jī)制研究[D];北京體育大學(xué);2018年

10 周盛;AMPK及Sclerostin在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制中的作用研究[D];南京大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 鄧蒂斯;補(bǔ)腎化痰法經(jīng)APN/AMPK信號(hào)通路治療肥胖PCOS的機(jī)制研究[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2018年

2 齊豹;小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中AMPK在周?chē)窠?jīng)再生中的實(shí)驗(yàn)研究[D];濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院;2018年

3 伍義蘭;二甲雙胍對(duì)大鼠肺纖維化模型肺組織中AMPK、LC3-Ⅱ表達(dá)的影響[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2018年

4 李楠;AMPK/mTOR信號(hào)通路在腹主動(dòng)脈瘤形成中的作用及其分子機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

5 張旭慧;小檗堿對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化的影響及其機(jī)制初探[D];河北醫(yī)科大學(xué);2018年

6 朱娟;二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK誘導(dǎo)自噬在大鼠窒息性心臟驟停/心肺復(fù)蘇模型發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2018年

7 范克瑞;脂多糖誘導(dǎo)的AMPK失活通過(guò)抑制自噬加重炎癥損傷的機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

8 蔡振煜;AMPK通路介導(dǎo)自噬調(diào)控高糖環(huán)境下破骨細(xì)胞形成與功能機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

9 馬驥;胰升糖素樣肽1對(duì)肥胖大鼠肝臟組織中Sesn2/AMPK/mTOR信號(hào)通路的干預(yù)效應(yīng)[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

10 張曦文;胰高血糖素樣肽-1對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠肝臟組織FGF21/AMPK通路的影響[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2653137