【摘要】：肝癌是全世界最常見六大癌癥,也是癌癥中導致死亡的第二大原因,我國肝癌的發(fā)病率在世界水平上相對較高,對還在處于發(fā)展中的中國的醫(yī)療和社會保障產(chǎn)生了嚴重的經(jīng)濟負擔。肝癌有著發(fā)現(xiàn)難,進展快的特點,目前還沒有標志物能夠準確檢測出早期肝癌,通常患者確診的時候已經(jīng)到達晚期,錯過了最佳手術(shù)治療時機。目前治療肝癌的靶向性藥物的特異性都不高,并且針對單一靶點的靶向藥物連續(xù)用藥后容易產(chǎn)生耐藥性,仍然需要找到針對更多靶點的藥物增加肝癌治療效果,延長患者的生存期,改善生活質(zhì)量。AMPK是一種與能量代謝相關(guān)的蛋白,當細胞中ATP低于閾值后會激活AMPK,抑制ATP消耗,包括脂質(zhì)、RNA和蛋白質(zhì)的合成。腫瘤細胞是一種高增殖的細胞,會消耗大量的ATP用于合成各種物質(zhì),腫瘤組織中AMPK的表達會比腫瘤周圍組織明顯減低,提示AMPK是一種潛在的抗腫瘤靶點。中醫(yī)中藥是我國傳統(tǒng)智慧的產(chǎn)物,有將近幾千年的歷史證明其有效性,現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)中藥的有效成分是一種重要的新藥來源,最新發(fā)現(xiàn)異土木香內(nèi)酯除了有抗菌殺蟲作用以外,還有抗腫瘤作用。因此本研究目的在于探索異土木香內(nèi)酯體內(nèi)外抗肝癌作用,是否通過AMPK信號通路產(chǎn)生作用,并且初步探索相關(guān)機制。本課題研究內(nèi)容分為三個部分。第一部分:異土木香內(nèi)酯的體外抗肝癌作用采用MTT檢測方法研究異土木香內(nèi)酯的體外抗肝癌效果,明確了其抗腫瘤的劑量和時間依賴性,并求出其IC_(50)。異土木香內(nèi)酯對Bel-7402 24 h、48 h和72 h的IC_(50)分別為37.4、25.46、22.36μM。HepG2則是34.82、26.32、20.22μM。第二部分:異土木香內(nèi)酯的體內(nèi)抗肝癌作用建立肝癌細胞Bel-7402的BALB/c荷瘤裸鼠模型。將異土木香內(nèi)酯制備脂質(zhì)體,每天灌胃給藥1次,連續(xù)用藥14天,隔天測量腫瘤體積和裸鼠重量,第15天處死動物后取腫瘤組織稱重。90 mg·kg~(-1)異土木香內(nèi)酯的體積抑制率有67.32%,重量抑制率有70.15%,并且其體內(nèi)抗腫瘤作用具有一定的安全性。第三部分:異土木香內(nèi)酯抗腫瘤機制研究利用Hoechst 33258觀察異土木香內(nèi)酯對肝癌細胞的形態(tài)改變。使用Annexin V-FITC、PI、DCFH-DA染色配合流式細胞儀檢測細胞凋亡、周期抑制、ROS生成情況。結(jié)果顯示40μM異土木香內(nèi)酯能夠誘導肝癌凋亡,將肝癌細胞增殖阻滯在G2/M期,同時可以顯著升高ROS水平。使用Western bolt和免疫組化檢測關(guān)鍵信號分子。結(jié)果發(fā)現(xiàn),40μM異土木香內(nèi)酯可以誘導p-AMPK、p53、Bax和Cleaved-Caspase3、Cleaved-Caspase9的表達水平升高,同時可以抑制CyclinB1、CDK1和Bcl-2蛋白質(zhì)表達水平的表達。免疫組化的結(jié)果顯示,腫瘤組織中的p-AMPK、p53和Caspase3蛋白質(zhì)表達也均會上調(diào)。綜上所述,異土木香內(nèi)酯在體內(nèi)外均有抗肝癌作用。機制是通過產(chǎn)生ROS,激活AMPK通路,上調(diào)p53調(diào)控因子而誘導肝癌細胞凋亡,同時還能將肝癌細胞的生長周期阻滯于G2/M期,通過多靶點的方式抑制肝癌增殖。本研究將為異土木香內(nèi)酯作為抗肝癌新藥的研發(fā)和臨床精準化使用奠定理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

X 軸為濃度，，Y 軸為抑制率作出柱形圖，表上誤差線。利用 GraphPad prism6.0的分析功能，把 X 軸換算成 LogX，根據(jù)三次的增殖抑制率分析算出三個孵育時間的 IC50。2.5.2 實驗結(jié)果MTT 實驗證明，IAL 對肝癌 Bel-7402 和 HepG2 均有明顯的體外抑制作用，并且具有劑量依賴性和時間依賴性。經(jīng)過 SPSS22.0 的 Levene 方差齊性檢驗，顯示方差齊，F(xiàn) 檢驗顯示各組之間有顯著差異（p<0.01）；使用 LSD 統(tǒng)計兩組之間差異，與空白組對比，大部分都有差異（見圖 2-1）。把不同濃度不同時間段的抑制率輸入 GraphPad prism6.0 計算，得出 IC50（見表 2-1）。在 24h 時間點上，20μM 以下濃度的 IAL 對于 HepG2 幾乎沒有抑制作用，濃度一旦到達 40μM 則抑制率增大至60%以上，可以認為 HepG2 細胞有某個耐藥的閾值，而 IAL 對 Bel-7402 則沒有這種現(xiàn)象，IC50也比 HepG2 高。根據(jù) MTT 的結(jié)果，兩種肝癌細胞在給藥 48h 后，40μM和 80μM 已經(jīng)超過 90%的抑制率，兩組之間差異不大，故認為對于體外實驗超過24 h 后 40 μM 即可使細胞進入大量死亡狀態(tài)，高濃度藥效差異消失。

圖 3-1 荷瘤裸鼠體重變化趨勢（Mean SD，n=6）Fig.3-1 Weight changes of tumor-bearing nude mice（Mean SD，n=6）在實驗進行期間，可以觀察到裸鼠的皮下腫瘤隨時間變大，觸摸腫瘤位置固定，手感結(jié)實。根據(jù)隔天度量的體積數(shù)據(jù)，以實驗天數(shù)為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標作點線圖，標出誤差線（見圖 3-2）。統(tǒng)計每天的體重數(shù)據(jù)，經(jīng)過 Levene 方差齊性檢驗，顯示每天均方差齊。接著使用 F 檢驗，第三天開始各組間出現(xiàn)差異（p<0.05），第十一天開始有明顯差異（p<0.01）。使用 LSD 在模型組與各組之間對比，直到第九天，5-FU 組和 IAL-H 組開始出出現(xiàn)差異（p<0.05），隔天差異明顯（p<0.01）。IAL-M 組和 IAL-L 組也會出現(xiàn)差異，不過出現(xiàn)時間會相對推遲。在實驗期間，脂質(zhì)體對照組始終與模型組沒有差異（p>0.05）。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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