【摘要】：目的:研究化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)的RASMC分泌炎癥因子、增殖、遷移、凋亡、表型轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制是否受MAPKs信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。方法:1.含藥血清的制備:選取16只2.5±0.53彽腟D日本大耳白兔,隨機(jī)分為四組:瑞舒伐他汀組(RS,2.5mg/kg/d)、化痰活血解毒方低劑量組(ZD,17.2mg/kg/d)、化痰活血解毒方高劑量組(ZG,34.4mg/kg/d)和空白組(Control,同等體積的生理鹽水),連續(xù)灌胃7天,末次給藥3小時(shí)腹主動(dòng)脈取血、取上清,過(guò)濾、滅活,-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.實(shí)驗(yàn)分組:本實(shí)驗(yàn)共分為5組:空白組、LPS組、LPS+瑞舒伐他汀組、LPS+化痰活血解毒方低劑量組、LPS+化痰活血解毒方高劑量組。3.MTT法檢測(cè)LPS對(duì)RASMC增殖的影響。4.MTT法檢測(cè)化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)的RASMC增殖的干預(yù)作用。5.ELISA法檢測(cè)化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)的RASMC分泌炎癥因子及TIMP-1表達(dá)的作用。6.流式細(xì)胞儀檢測(cè)化痰活血解毒方對(duì)RASMC凋亡的影響。7.Transwell小室檢測(cè)化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)的RASMC遷移的作用。8.RT-PCR和Weston blotting檢測(cè)RASMC中MAPKs信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白(p38MAPK、ERK、JNK)、主要表型標(biāo)志基因和蛋白(α-SM-actin、OPN)及相關(guān)凋亡基因和蛋白(caspase-3,Bax,Bcl-2)的表達(dá)水平。結(jié)果:1.LPS對(duì)RASMC生長(zhǎng)及增殖的影響:0.01、0.1、0.5、1、5、10μg/ml濃度的LPS作用RASMC 6、12、24、48h細(xì)胞活力均顯著增強(qiáng)(P0.05);100μg/ml濃度的LPS作用6、12、24h細(xì)胞活力上升(P0.05),但作用48h細(xì)胞活力顯著下降(P0.05)。0.5μg/ml濃度的LPS作用24h的促增殖能力最顯著(P0.05)。2.化痰活血解毒方對(duì)LPS作用下RASMC增殖活性的影響:10%、20%、40%濃度的瑞舒伐他汀和高劑量化痰活血解毒方作用24、48h均能顯著抑制LPS的促增殖作用(P0.05),二者之間無(wú)顯著差異(P0.05);10%濃度的化痰活血解毒方低劑量組作用24h及20%、40%濃度的化痰活血解毒方低劑量組作用24、48h均可以抑制LPS的促增殖作用(P0.05),但顯著弱于瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組(P㩳0.05)。3.化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)RASMC分泌炎癥因子的干預(yù)作用:與空白組相比,LPS組TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1的比例顯著升高、TIMP-1水平顯著降低(P0.05)。與LPS組相比,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9水平及MMP-9/TIMP-1的比例顯著降低,TIMP-1水平顯著升高(P0.05)。瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組間TNF-α水平無(wú)顯著差異(P0.05),瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組TNF-α水平顯著高于化痰活血解毒方高劑量組(P0.05);瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組三者之間IL-6水平無(wú)顯著差異(P0.05);化痰活血解毒方高劑量組MCP-1水平顯著低于化痰活血解毒方低劑量組(P0.05),瑞舒伐他汀組MCP-1水平顯著低于化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組(P0.05);瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組間MMP-9水平無(wú)顯著差異(P0.05),化痰活血解毒方高劑量組MMP-9水平顯著低于瑞舒伐他汀組(P0.05),化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組間MMP-9水平無(wú)顯著差異(P0.05);瑞舒伐他汀組TIMP-1水平顯著高于化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組(P0.05),化痰活血解毒方高劑量組TIMP-1表達(dá)水平顯著低于化痰活血解毒方低劑量組(P0.05);瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組之間MMP-9/TIMP-1的比例無(wú)顯著差異(P0.05)。4.化痰活血解毒方對(duì)LPS作用下RASMC凋亡的影響:與空白組比較,LPS組RASMC凋亡率顯著降低(P0.05);與LPS組比較,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組的凋亡率顯著升高(P0.05);瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組間的凋亡率無(wú)顯著差異(P0.05),瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組間的凋亡率顯著高于化痰活血解毒方低劑量組(P0.05)。5.化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)下RASMC遷移能力的影響:與空白組比較,LPS組的RASMC遷移能力顯著提高(P0.05);與LPS組比較,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組RASMC的遷移能力均顯著降低(P0.05);瑞舒伐他汀組與化痰活血解毒方高劑量組間的遷移能力無(wú)顯著差異(P0.05),瑞舒伐他汀組與化痰活血解毒方高劑量組的遷移能力顯著高于化痰活血解毒方低劑量組(P0.05)。6.化痰活血解毒方對(duì)RASMC表型轉(zhuǎn)化的影響:與空白組比較,LPS組α-SM-actin mRNA和蛋白的表達(dá)減少(P0.05),OPNmRNA和蛋白表達(dá)升高(P0.05);與LPS組比較,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組α-SM-actin mRNA和蛋白的表達(dá)升高(P0.05)和OPNmRNA和蛋白表達(dá)減少(P0.05);瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組抑制RASMC表型變化無(wú)顯著差異(P0.05),化痰活血解毒方低劑量組抑制RASMC表型變化弱于瑞舒伐他汀組與化痰活血解毒方高劑量組(P0.05)。7.化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)RASMC中ERk、p38MAPK、JNKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白表達(dá)的影響:與空白組比較,LPS組E RK1/2、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白的表達(dá)水平顯著升高(P0.05);與LPS組比較,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組ERK1/2、JNK、p-38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-p38MAPK、p-JNK蛋白的表達(dá)水平顯著降低(P0.05);瑞舒伐他汀組與化痰活血解毒方高劑量組之間ERK、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(P0.05),化痰活血解毒方低劑量組ERK、JNK、p38MAPKmRNA及p-ERK1/2、p-JNK蛋白的表達(dá)水平顯著高于瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組(P0.05);化痰活血解毒方高劑量組p-p38MAPK蛋白的表達(dá)水平顯著低于瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組(P0.05),化痰活血解毒方低劑量組p-p38MAPK蛋白水平顯著高于瑞舒伐他汀組(P0.05)。8.化痰活血解毒方對(duì)LPS誘導(dǎo)的RASMC Bax、caspase-3、Bcl-2mRNA和蛋白的表達(dá)的影響:與空白組比較,LPS組促凋亡蛋白Bax、caspase-3mRNA和蛋白的表達(dá)降低(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)升高;與LPS組比較,瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方低劑量組、化痰活血解毒方高劑量組組促凋亡蛋白bax、caspase3mRNA和蛋白的表達(dá)水平升高(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2mRNA和蛋白表達(dá)降低(P0.05)。結(jié)論:1.LPS可明顯促進(jìn)RASMC的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化并可誘導(dǎo)RASMC分泌TNF-α、IL-6、MCP-1、MMP-9及降低TIMP-1的表達(dá)。2.化痰活血解毒方可顯著降低LPS誘導(dǎo)的RASMC分泌炎癥因子的水平及上調(diào)TIMP-1的表達(dá),誘導(dǎo)RASMC凋亡、抑制RASMC的增殖、遷移及表型轉(zhuǎn)化。3.化痰活血解毒方干預(yù)炎癥反應(yīng),抑制RASMC的增殖、遷移和表型轉(zhuǎn)化可能與抑制MAPKs信號(hào)通路有關(guān)。4.化痰活血解毒方可以顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的RASMC凋亡可能是通過(guò)抑制ERK信號(hào)通路,下調(diào)Bcl-2、上調(diào)Bax、caspase-3蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

血清、⑤LPS+化痰活血解毒方高劑量組：RASMC+0.5μg/ml LPS+40%高劑量化痰活血解毒方含藥血清圖1 技術(shù)路線圖2.6 MTT 法檢測(cè) LPS 對(duì) RASMC 增殖的影響及化痰活血解毒方的干預(yù)作用2.6.1 細(xì)胞分組（1）LPS 的濃度、時(shí)間梯度組：①對(duì)照組：RASMC+10%FBS 培養(yǎng)基、②LPS 刺激組：RASMC+10%FBS 培養(yǎng)基+不同濃度 LPS(0.1μg/ml、0.01μ g/ ml、 0.5μ g/ ml、 1μ g/ ml、 10μ g/ ml、 100μ g/ ml），各組的 LPS作用時(shí)間分別為6h、12h、24h、48h。（2）含藥血清干預(yù)組：0.5μg/ml LPS 誘導(dǎo) RASMC 24h 后分別加入5%、 10%、 20%、 40%濃度的空白血清、瑞舒伐他汀含藥血清、低劑量化痰活血解毒方含藥血清、高劑量化痰活血解毒方含藥血清，分別干預(yù)24h、48h。

圖 2 LPS 對(duì) RASMC 活力的影響0μg/ml 濃度的 LPS 比較，aP＜0.05；與 0.5μg/ml 濃度bP＜0.05活血解毒方對(duì) LPS 促 RASMC 增殖的干預(yù)作用μ g/ ml 濃度的 LPS 誘導(dǎo) RASMC 24h 后加入 5%、10%、20空白血清、瑞舒伐他汀血清、化痰活血解毒方血清作用24果顯示：與空白組比較，LPS 作用24、48h 均可促進(jìn) RAS0.05）。與 LPS 組相比，5%濃度的含藥血清均不能抑制 的增殖作用（ P＞ 0.05），，而 10%濃度的瑞舒伐他汀和高劑毒方均能抑制 LPS 對(duì) RASMC 的增殖作用（P＜0.05），二差異（P＞0.05）。與 LPS 組比較，10%濃度的化痰活血解干預(yù)24h 能抑制 LPS 對(duì) RASMC 的增殖，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意但弱于瑞舒伐他汀組、化痰活血解毒方高劑量組（ P㩳 0.
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2653175