本文關(guān)鍵詞：程序性壞死與自噬在亞硫酸鈉致肝細(xì)胞損傷中的作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:研究程序性壞死與自噬在亞硫酸鈉引起的肝細(xì)胞損傷中的作用,為探討亞硫酸鈉的肝毒性機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。方法:第一部分:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702分別暴露于不同濃度的Na2SO3,其終濃度分別為0.01、0.1、1和10 mmol/L,并設(shè)陰性對(duì)照組(0 mmol/L)、陽(yáng)性對(duì)照組(50 mmol/L CCl4)、0.5%DMSO溶劑對(duì)照組。分別染毒2 h、4 h、12 h、24 h以及48h后,用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;采用CCK-8法檢測(cè)Na2SO3對(duì)肝細(xì)胞活性的影響;采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)不同時(shí)間段各染毒組肝細(xì)胞培養(yǎng)上清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)以及乳酸脫氫酶(LDH)的活性;采用Western Blot法檢測(cè)程序性壞死相關(guān)蛋白受體相互作用蛋白1(RIP1)的表達(dá)水平。第二部分:將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HL-7702分別暴露于不同濃度的Na2SO3,其終濃度分別為0.1、1、2.5和5 mmol/L,并設(shè)陰性對(duì)照組(0 mmol/L)、陽(yáng)性對(duì)照組(20mmol/L CCl4)、0.2%DMSO溶劑對(duì)照組。分別染毒2 h、4 h、12 h、24 h以及48 h后,采用熒光素酶化學(xué)發(fā)光法測(cè)定肝細(xì)胞內(nèi)ATP含量;用免疫熒光(IF)法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá);用Western Blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62及AMPK蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:第一部分:(1)與陰性對(duì)照組相比,染毒24h和48h,10 mmol/L Na2SO3能引起肝細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,染毒2h-48h,1和10 mmol/L Na2SO3引起肝細(xì)胞活性明顯降低(P0.05);(2)與陰性對(duì)照組相比,僅10 mmol/L Na2SO3染毒24、48 h HL-7702細(xì)胞上清液中的ALT活力較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);1 mmol/L亞硫酸鈉染毒4、24 h及10 mmol/L Na2SO3染毒2、4 h HL-7702細(xì)胞上清液中的AST活力較低,而10 mmol/L Na2SO3染毒24、48 h HL-7702細(xì)胞上清液中的AST活力較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);10 mmol/L Na2SO3染毒2、4 h HL-7702細(xì)胞上清液中的LDH活力較低,而染毒24、48 h HL-7702細(xì)胞上清液中的LDH活力較高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)與陰性對(duì)照組相比,染毒2h-48h各濃度Na2SO3染毒組HL-7702細(xì)胞中RIP1蛋白的表達(dá)水平均較高,差異多有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。第二部分:(1)與陰性對(duì)照組相比,亞硫酸鈉各染毒組細(xì)胞內(nèi)ATP濃度明顯增加,并且隨著染毒劑量的增加有上升的趨勢(shì);陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞ATP濃度明顯增加(P0.05);(2)與陰性對(duì)照組相比,各亞硫酸鈉染毒組HL-7702細(xì)胞中表征LC3蛋白表達(dá)含量的綠色熒光強(qiáng)度明顯增加,陽(yáng)性對(duì)照組HL-7702細(xì)胞中的綠色熒光強(qiáng)度也明顯增加,尤其是24 h和48 h更為顯著,提示亞硫酸鈉染毒可使HL-7702細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)量增加;(3)與陰性對(duì)照組相比,2-24 h Na2SO3各染毒組LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)均明顯增加(P0.05);48 h Na2SO3各染毒組,隨著染毒劑量的增加,LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)量呈降低趨勢(shì);與陰性對(duì)照組相比,2-24 h Na2SO3各染毒組p62蛋白表達(dá)均明顯增加(P0.05);而48 h Na2SO3各染毒組,隨著染毒劑量的增加,p62蛋白表達(dá)逐漸降低;與陰性對(duì)照組相比,2-48 h Na2SO3各染毒組AMPK蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論:(1)亞硫酸鈉引起RIP1蛋白表達(dá)增加的時(shí)間明顯早于肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的時(shí)間,染毒劑量也明顯低于細(xì)胞活性改變的劑量,因此,亞硫酸鈉可能通過(guò)程序性壞死相關(guān)途徑引起肝細(xì)胞損傷。(2)亞硫酸鈉能引起肝細(xì)胞內(nèi)LC3和p62蛋白表達(dá)先明顯增加,后減少,說(shuō)明亞硫酸鈉能夠促進(jìn)肝細(xì)胞自噬作用增強(qiáng),一定程度上減輕亞硫酸鈉對(duì)肝細(xì)胞的程序性壞死的誘導(dǎo)作用。
【關(guān)鍵詞】：亞硫酸鈉 肝損傷 程序性壞死 自噬
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R114
【目錄】：

• 摘要6-8
• abstract8-11
• 常用縮寫(xiě)詞中英文對(duì)照表11-12
• 前言12-14
• 第一部分 程序性壞死在亞硫酸鈉致肝細(xì)胞損傷中的作用14-29
• 1 材料與方法14-19
• 1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株14
• 1.2 主要儀器與試劑14-16
• 1.3 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存16-17
• 1.4 實(shí)驗(yàn)分組及染毒17-18
• 1.5 實(shí)驗(yàn)方法18-19
• 1.6 數(shù)據(jù)分析19
• 2 結(jié)果19-26
• 2.1 HL-7702細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變19-22
• 2.2 亞硫酸鈉染毒對(duì)HL-7702細(xì)胞活性的影響22-23
• 2.3 亞硫酸鈉染毒對(duì)HL-7702細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ALT、AST、LDH活性的影響23-24
• 2.4 亞硫酸鈉染毒對(duì)HL-7702細(xì)胞RIP1蛋白表達(dá)的影響24-26
• 3 討論26-28
• 4 結(jié)論28-29
• 第二部分 自噬在亞硫酸鈉致肝細(xì)胞損傷中的作用29-46
• 1 材料與方法29-33
• 1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株29
• 1.2 主要儀器與試劑29-31
• 1.3 細(xì)胞的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代及凍存31
• 1.4 實(shí)驗(yàn)分組及染毒31
• 1.5 實(shí)驗(yàn)方法31-33
• 1.6 數(shù)據(jù)分析33
• 2 結(jié)果33-42
• 2.1 亞硫酸鈉染毒對(duì)HL-7702細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響33
• 2.2 免疫熒光法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)結(jié)果和Hoechst33258細(xì)胞核染色結(jié)果33-39
• 2.3 亞硫酸鈉染毒對(duì)HL-7702細(xì)胞LC3、SQSTM1/p62及AMPK蛋白表達(dá)的影響39-42
• 3 討論42-45
• 4 結(jié)論45-46
• 參考文獻(xiàn)46-51
• 綜述51-60
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60-61
• 在學(xué)期間承擔(dān)/參與的科研課題與研究成果61-62
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷62

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