本文關(guān)鍵詞：抑制Beclin1促進(jìn)TOCP誘導(dǎo)人成神經(jīng)瘤SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 探討自噬與凋亡在三鄰甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）誘發(fā)SH-SY5Y細(xì)胞神經(jīng)毒性中的關(guān)系，進(jìn)一步闡述TOCP神經(jīng)毒性的作用機(jī)制。 方法 1．采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達(dá)載體；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，G418篩選出Beclin1穩(wěn)定低表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞系（sh-Beclin1細(xì)胞系），RT-PCR與Western blot檢測(cè)sh-Beclin1細(xì)胞系Beclin1基因的mRNA與蛋白表達(dá)。 2．不同濃度TOCP（0，0.5mM）分別處理SH-SY5Y細(xì)胞與sh-Beclin1細(xì)胞48h，MDC染色觀察兩組細(xì)胞系自噬泡的數(shù)量變化，Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞中LC3-II蛋白的表達(dá)。 3．不同濃度TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）分別處理SH-SY5Y細(xì)胞與sh-Beclin1細(xì)胞48h，Hoechst33258染色觀察兩組細(xì)胞系細(xì)胞核形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組細(xì)胞系細(xì)胞周期的變化,Western blot檢測(cè)兩組細(xì)胞系凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1．測(cè)序證實(shí)pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Western blot技術(shù)鑒定Beclin1基因穩(wěn)定敲減SH-SY5Y細(xì)胞系建立成功。 2．MDC染色結(jié)果和Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞比較，TOCP (0.5mmol/L)處理sh-Beclin1細(xì)胞系48h后，產(chǎn)生自噬泡的數(shù)量明顯減少，LC3-II蛋白表達(dá)明顯降低。 3．與對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞比較，sh-Beclin1細(xì)胞經(jīng)不同濃度TOCP（0，1.0mM）處理48h后進(jìn)行Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞核藍(lán)色熒光增強(qiáng)，染色質(zhì)聚集明顯，，且有部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞核碎裂、溶解，細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象，且產(chǎn)生核碎裂的細(xì)胞數(shù)量隨TOCP濃度升高而增加。 4．不同濃度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）處理SH-SY5Y細(xì)胞和sh-Beclin1細(xì)胞48h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示：與對(duì)照組SH-SY5Y細(xì)胞比較，sh-Beclin1細(xì)胞G1期前有亞二倍體凋亡峰的出現(xiàn)，并凋亡細(xì)胞數(shù)量隨著TOCP濃度增高而增多，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系（P0.05）。 5．不同濃度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）處理SH-SY5Y細(xì)胞和sh-Beclin1細(xì)胞48h后，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：在SH-SY5Y細(xì)胞中，凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax比值無(wú)升高或降低趨勢(shì)，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化，在sh-Beclin1細(xì)胞中，凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax比值呈降低，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（P0.05），cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化。 結(jié)論 1．干擾Beclin1基因的表達(dá)可抑制TOCP誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生自噬，Beclin1蛋白在TOCP誘導(dǎo)的自噬中起重要的作用。 2．TOCP誘發(fā)Beclin1基因敲減SH-SY5Y細(xì)胞系產(chǎn)生線(xiàn)粒體介導(dǎo)的非Caspase-3依賴(lài)的凋亡。
【關(guān)鍵詞】：三鄰甲苯基磷酸酯 Beclin1 RNAi 自噬 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R114
【目錄】：

• 主要英文縮略語(yǔ)索引4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料與方法11-25
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料11-14
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法14-25
• 結(jié)果25-32
• 1 shRNA 真核表達(dá)載體的構(gòu)建25-26
• 2 轉(zhuǎn)染 SH-SY5Y 及穩(wěn)定細(xì)胞系的建立26-28
• 3 MDC 染色觀察自噬泡的變化28-29
• 4 western-bolt 檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白 LC3-II 表達(dá)29
• 5 Hoechst 33258 染色29-30
• 6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期30-31
• 7 western-bolt 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)31-32
• 討論32-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-42
• 附錄42-46
• 綜述46-55
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 在讀期間發(fā)表的科研論文和參與的科研項(xiàng)目55-56
• 致謝56

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 龍鼎新;伍一軍;蔣偉;;TOCP對(duì)人成神經(jīng)瘤細(xì)胞SH-SY5Y的氧化損傷作用[J];中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志;2011年03期

2 常平安;伍一軍;;有機(jī)磷酸酯誘發(fā)的遲發(fā)性神經(jīng)病靶標(biāo)酯酶的老化機(jī)制[J];中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2005年06期

  本文關(guān)鍵詞：抑制Beclin1促進(jìn)TOCP誘導(dǎo)人成神經(jīng)瘤SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：381885