發(fā)布時間：2022-10-08 16:33

　　目的:錳（Manganese,Mn）作為人體必需微量元素之一,參與體內(nèi)多種重要激酶的構(gòu)成和生物反應(yīng),對維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能十分重要。然而,長期慢性的Mn暴露可以引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷,神經(jīng)行為發(fā)生異常改變,表現(xiàn)為類帕金森樣綜合征,即錳中毒。由于錳在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛使用,職業(yè)性Mn暴露已成為引發(fā)神經(jīng)退行性疾病的重要環(huán)境致病因素。關(guān)于Mn引起的神經(jīng)毒作用機制研究有很多,包括線粒體損傷,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,氧化應(yīng)激損傷,α-突觸核蛋白（Alpha-synuclein,α-Syn）寡聚化,自噬功能異常等等。自噬作為機體的降解/再循環(huán)系統(tǒng),參與維持體內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)凋亡。目前有研究發(fā)現(xiàn)自噬功能異常與神經(jīng)退行性變密切相關(guān),因此,在錳誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性過程中,其誘導(dǎo)的α-Syn寡聚化與自噬功能異常之間存在著非常復(fù)雜的關(guān)系,亟待研究。自噬作為機體的保護性機制,受多種信號通路調(diào)節(jié),如mTOR-ULK和Beclin1-PIK3C3。mTOR（Mammalian target of rapamycin）信號通路的抑制與自噬活化有關(guān)。Beclin1可以與胞漿內(nèi)的高遷移率族蛋白1（High-mobility group ... 

【文章頁數(shù)】：148 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略語
第一部分:α-Syn蛋白對錳誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細胞自噬的影響
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 研究對象和分組
        2.3 測定指標及方法
            2.3.1 基因型鑒定
            2.3.2 神經(jīng)行為學(xué)測試
            2.3.3 紋狀體錳含量測定
            2.3.4 腦內(nèi)Lamp2A、HSC70和α-Syn mRNA相對表達水平檢測
            2.3.5 檢測紋狀體內(nèi)Lamp2A、HSC70、Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚體的表達水平
            2.3.6 檢測紋狀體細胞凋亡和自噬發(fā)生水平
            2.3.7 激光共聚焦觀察Lamp2A與 HSC70、α-Syn蛋白共定位情況
            2.3.8 免疫共沉淀技術(shù)分析Lamp2A與 HSC70、α-Syn蛋白間的相互作用
            2.3.9 透射電鏡觀察自噬體的形成
        2.4 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 錳暴露引起α-Syn~(+/+)和α-Syn~(-/-)小鼠的異常行為學(xué)改變
            3.1.1 Open field實驗結(jié)果
            3.1.2 強迫游泳、爪抓力以及雙足平衡實驗結(jié)果
        3.2 α-Syn對腦錳含量及神經(jīng)細胞損傷的影響
            3.2.1 紋狀體錳含量情況
            3.2.2 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響
        3.3 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠神經(jīng)細胞自噬的影響
        3.4 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠自噬CMA途徑的影響
            3.4.1 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70 mRNA及蛋白表達的影響
            3.4.2 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠Lamp2A和 HSC70共定位以及相互作用的影響
            3.4.3 CMA途徑可能參與錳誘導(dǎo)的α-Syn過表達的降解
        3.5 錳暴露對α-Syn~(+/+)和 α-Syn~(-/-)型小鼠巨自噬的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
第二部分:自噬對錳誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)細胞α-Syn蛋白寡聚化的影響
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 研究對象和分組
        2.3 測定指標及方法
            2.3.1 神經(jīng)行為學(xué)測試
            2.3.2 紋狀體錳含量測定
            2.3.3 檢測紋狀體細胞凋亡和自噬發(fā)生水平
            2.3.4 紋狀體α-Syn mRNA相對表達水平檢測
            2.3.5 檢測紋狀體內(nèi)Beclin1、LC3B、p62和α-Syn蛋白寡聚體的表達水平
        2.4 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 錳暴露對小鼠神經(jīng)行為的影響
            3.1.1 Open field實驗結(jié)果
            3.1.2 強迫游泳、爪抓力以及雙足平衡實驗結(jié)果
        3.2 Rap和3-MA對錳神經(jīng)毒性的影響
            3.2.1 Rap和3-MA對紋狀體錳含量的影響
            3.2.2 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡的影響
        3.3 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)自噬的影響
            3.3.1 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)自噬水平的影響
            3.3.2 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白表達的影響
        3.4 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)α-Syn寡聚化的影響
            3.4.1 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)α-Syn mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響
            3.4.2 Rap和3-MA對錳誘導(dǎo)α-Syn蛋白表達水平的影響
    4 討論
    5 結(jié)論
第三部分:柯諾辛堿B緩解錳誘導(dǎo)的α-Syn干擾自噬活化的機制研究
    1 前言
    2 材料與方法
        2.1 主要試劑和儀器
            2.1.1 主要試劑
            2.1.2 主要儀器
        2.2 SH-SY5Y細胞培養(yǎng)、傳代和處理
        2.3 測定指標及方法
            2.3.1 細胞活力和毒性分析
            2.3.2 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達水平
            2.3.3 細胞凋亡檢測
            2.3.4 細胞自噬水平分析
            2.3.5 激光共聚焦觀察HMGB1與α-Syn、HMGB1與Beclin1、Beclin1 與Bcl2 的共定位以及HMGB1 的亞細胞定位情況
            2.3.6 免疫共沉淀分析胞漿內(nèi)HMGB1與α-Syn、HMGB1與Beclin1、Beclin1與Bcl2 蛋白間相互作用
            2.3.7 Real-time PCR檢測HMGB1 mRNA水平
            2.3.8 Ad-mCherry-CFP-LC3B腺病毒檢測自噬流變化
        2.4 統(tǒng)計分析
    3 結(jié)果
        3.1 錳的細胞毒性分析
        3.2 錳暴露誘導(dǎo)HMGB1 發(fā)生胞漿轉(zhuǎn)位
        3.3 錳暴露對HMGB1與Beclin1 蛋白相互作用的影響
        3.4 錳對SH-SY5Y細胞自噬的影響
        3.5 錳誘導(dǎo)α-Syn過表達干擾HMGB1與Beclin1、Beclin1與Bcl2 的結(jié)合
            3.5.1 錳誘導(dǎo)α-Syn、Bcl2 蛋白表達增多
            3.5.2 錳誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞胞漿中α-Syn與 HMGB1 結(jié)合增多
            3.5.3 錳暴露引起B(yǎng)eclin1與Bcl2 結(jié)合增多
        3.6 Cory B可以緩解錳引起的神經(jīng)細胞損傷和自噬功能障礙
            3.6.1 Cory B緩解錳引起的細胞損傷
            3.6.2 Cory B緩解錳引起自噬功能異常
        3.7 Cory B可以解離α-Syn與 HMGB1 的結(jié)合,增強HMGB1與Beclin1,減弱Beclin1與Bcl2 的結(jié)合
            3.7.1 Cory B對 α-Syn、Bcl2 表達的影響
            3.7.2 Cory B減弱錳誘導(dǎo)的α-Syn與 HMGB1 結(jié)合增多
            3.7.3 Cory B改善錳誘導(dǎo)HMGB1與Beclin1 結(jié)合減少
            3.7.4 Cory B減弱錳誘導(dǎo)的Beclin1與Bcl2 結(jié)合增多
        3.8 Cory B可以調(diào)控mTOR信號通路,影響自噬
    4 討論
    5 結(jié)論
本研究創(chuàng)新性的自我評價
參考文獻
綜述
    參考文獻
攻讀學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
個人簡歷



本文編號：3688050