本研究建立了四個(gè)常規(guī)PCR體系來(lái)檢測(cè)食品中的谷物致敏原,它們分別是小麥特異性PCR體系Wheat217bp,燕麥特異性PCR體系Oatl71bp,大麥和黑麥的共同PCR體系BR108bp以及小麥、大麥和黑麥的共同PCR體系WBR155bp。通過(guò)使用不同裂解液處理樣品以及對(duì)提取結(jié)果的比較,為谷物樣品確定了最佳DNA提取方法。針對(duì)小麥的致敏蛋白一ω-醇溶谷蛋白和燕麥的致敏蛋白—燕麥蛋白,利用專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件Primer3.0分別為它們?cè)O(shè)計(jì)特異性強(qiáng)的引物。運(yùn)用軟件ClustalW對(duì)小麥、大麥和黑麥的相關(guān)致敏蛋白編碼序列進(jìn)行同源性分析,并確定同源區(qū)域,然后針對(duì)同源區(qū)域運(yùn)用專業(yè)引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)共同引物。在尋找黑麥和大麥各自特異性引物的過(guò)程中,找到了大麥和黑麥的一個(gè)共同引物,并發(fā)現(xiàn)了黑麥的一段新序列,此序列目前還沒(méi)在有關(guān)核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中公布。PCR擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳以及凝膠成像系統(tǒng)分析后,并經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步確證。結(jié)果表明各PCR體系具有較強(qiáng)特異性,理論檢出限和實(shí)際檢出限都至少分別可達(dá)1.0ng/μL和1.0%,擴(kuò)增產(chǎn)物與目標(biāo)序列具有很高匹配度,而且能檢測(cè)熱加工食品中... 

【文章來(lái)源】：華東理工大學(xué)上海市 211工程院校 教育部直屬院校

【文章頁(yè)數(shù)】：90 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第1章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 食物致敏
        1.1.1 食物致敏原的種類和危害
        1.1.2 致敏蛋白種類
        1.1.3 食物致敏原檢測(cè)的必要性和重要性
    1.2 食物致敏原的檢測(cè)方法
        1.2.1 基于蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法
        1.2.2 生物學(xué)方法的不足之處
        1.2.3 基于DNA的檢測(cè)方法
        1.2.4 食物中致敏原的新興檢測(cè)技術(shù)
    1.3 食物致敏原的相關(guān)法律法規(guī)
        1.3.1 國(guó)外已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)
        1.3.2 我國(guó)已頒布的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)
    1.4 本課題的研究?jī)?nèi)容及意義
        1.4.1 選定谷物致敏原為研究對(duì)象的背景及意義
        1.4.2 采用PCR法檢測(cè)食物中谷物致敏原的意義及優(yōu)越性
第2章 樣品前處理和引物篩選
    2.1 引言
    2.2 材料與設(shè)備
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    2.3 實(shí)驗(yàn)方法
        2.3.1 谷物樣品的前處理方法
        2.3.2 采用植物通用引物tRNALeu驗(yàn)證樣品DNA的擴(kuò)增性
        2.3.3 目標(biāo)序列查詢
        2.3.4 引物的設(shè)計(jì)方案
        2.3.5 訂購(gòu)引物的處理方法
        2.3.6 引物特異性實(shí)驗(yàn)條件的摸索及優(yōu)化
        2.3.7 瓊脂糖凝膠電泳條件的選擇及優(yōu)化
    2.4 結(jié)果與討論
        2.4.1 DNA提取方法的選擇
        2.4.2 樣品DNA擴(kuò)增性的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果
        2.4.3 目標(biāo)序列的選擇及論證確定
        2.4.4 引物特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與討論
        2.4.5 瓊脂糖凝膠電泳條件的優(yōu)化結(jié)果
    2.5 本章小結(jié)
第3章 共同引物檢測(cè)食品中谷物致敏原
    3.1 引言
    3.2 材料與設(shè)備
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    3.3 實(shí)驗(yàn)方法
        3.3.1 目標(biāo)序列查詢
        3.3.2 引物的設(shè)計(jì)方案
        3.3.3 引物特異性實(shí)驗(yàn)條件的摸索及優(yōu)化
    3.4 結(jié)果與討論
        3.4.1 目標(biāo)序列的選擇及論證確定
        3.4.2 共同引物特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論
    3.5 本章小結(jié)
第4章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果確證和實(shí)樣檢測(cè)
    4.1 引言
    4.2 材料與設(shè)備
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
    4.3 實(shí)驗(yàn)方法
        4.3.1 PCR產(chǎn)物的測(cè)序
        4.3.2 各PCR體系的檢出限實(shí)驗(yàn)
        4.3.3 實(shí)樣檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
    4.4 結(jié)果與討論
        4.4.1 測(cè)序結(jié)果比對(duì)及討論
        4.4.2 各PCR體系的檢出限討論
        4.4.3 實(shí)樣檢測(cè)結(jié)果及討論
    4.5 本章小結(jié)
第5章 ELISA方法驗(yàn)證WBR-PCR體系的可靠性
    5.1 引言
    5.2 材料與設(shè)備
        5.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        5.2.2 儀器與設(shè)備
    5.3 實(shí)驗(yàn)方法
        5.3.1 樣品的前處理
        5.3.2 ELISA測(cè)定程序
        5.3.3 樣品稀釋條件的研究
        5.3.4 陽(yáng)性質(zhì)控確證試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)
        5.3.5 精密度試驗(yàn)
        5.3.6 ELISA與WBR-PCR體系的檢測(cè)結(jié)果比較
    5.4 結(jié)果與討論
        5.4.1 ELISA方法的工作曲線
        5.4.2 檢出限和線性范圍
        5.4.3 樣品稀釋條件的摸索結(jié)果
        5.4.4 質(zhì)控確證和回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.5 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.4.6 ELISA與PCR兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較
第6章 總結(jié)與展望
    6.1 本研究的成果總結(jié)
    6.2 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)
    6.3 可進(jìn)一步改進(jìn)和優(yōu)化的部分
    6.4 致敏原檢測(cè)的發(fā)展方向展望
參考文獻(xiàn)
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3233575