目的:本項(xiàng)目分別使用不同的鈣離子通道抑制劑工具藥和構(gòu)建CAPNS1基因敲除SK-N-SH細(xì)胞模型(CAPNS1^-/-)來(lái)研究calpain在三鄰甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP）引起SK-N-SH細(xì)胞自噬紊亂中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建CAPNS1基因敲除SK-N-SH細(xì)胞系(CAPNS1^-/-)。2.MTT法檢測(cè)TOCP（0、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L）對(duì)野生型SK-N-SH細(xì)胞(CAPNS1^+/+)和突變型SK-N-SH細(xì)胞(CAPNS1^-/-)增殖的影響,確定TOCP使用濃度。3.SK-N-SH細(xì)胞經(jīng)Verapamil、2-APB、CsA預(yù)處理后,0.75mmol/L TOCP染毒,使用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化和calpain活性變化,并用Western-blotting檢測(cè)細(xì)胞中calpain和自噬相關(guān)蛋白水平。4.野生型SK-N-SH細(xì)胞(CAPNS1^+/+... 

【文章來(lái)源】：南華大學(xué)湖南省

【文章頁(yè)數(shù)】：84 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

TOCP對(duì)SK-N-SH細(xì)胞增殖影響

TOCP對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響

活性為 142.79%（以對(duì)照組為 100%），與對(duì)照組相比，活性增加；同時(shí) Western-blot檢測(cè) calpain1 和 calpain2 蛋白水平，兩種蛋白水平上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而分別使用鈣離子通道抑制劑 2-APB、Verapamil 和 CsA 預(yù)處理再經(jīng)TOCP 染毒后，細(xì)胞內(nèi) calpain 活性分別為 126.15%、132.74%、125.80%，與 TOCP處理組相比，calpain 活性下降且 calpain1 及 calpain2 蛋白水平也有所下降（P<0.05），與鈣離子濃度變化趨勢(shì)一致。這些結(jié)果表明 TOCP 能夠使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加，從而激活 SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi) calpain 活性，使 SK-N-SH 細(xì)胞內(nèi)calpain1 和 calpain2 蛋白表達(dá)水平增加。

【參考文獻(xiàn)】：
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本文編號(hào)：2920226