發(fā)布時間：2020-09-22 09:08

　　 農(nóng)獸藥的不合理使用，導(dǎo)致其在土壤、水與農(nóng)產(chǎn)品中的殘留，造成環(huán)境污染并通過食物鏈的富集作用最終進(jìn)入食品，從而引發(fā)食品安全等一系列問題，不僅嚴(yán)重影響人們的身體健康，而且致使我國食品和農(nóng)產(chǎn)品出口遭遇國際貿(mào)易“綠色壁壘”，阻礙食品和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。目前常用的檢測方法包括氣相色譜法、液相色譜法以及氣-質(zhì)、液-質(zhì)聯(lián)用方法等，這些方法大多需要復(fù)雜冗長的前處理過程，不能實現(xiàn)樣品的快速檢測。隨著傳感器技術(shù)的發(fā)展，表面等離子體共振(surface plasmonresonance, SPR)傳感技術(shù)，具有實時、快速、無須標(biāo)記和樣品無損等優(yōu)點而受到了人們的青睞，并被廣泛應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)及食品和藥物檢測等領(lǐng)域。但由于某些樣品基質(zhì)復(fù)雜、待測物含量低，用SPR傳感器直接進(jìn)行檢測時，信號響應(yīng)較弱，靈敏度較低。因此，本研究基于SPR傳感平臺，結(jié)合分子印跡技術(shù)、免疫技術(shù)，并分別引入納米金、納米金標(biāo)記的二抗、磁納米顆粒作為信號放大材料，構(gòu)建信號放大SPR傳感系統(tǒng)，用于農(nóng)獸藥殘留的檢測。主要研究內(nèi)容分為以下幾個方面： 1、基于納米金信號放大的SPR分子印跡聚合膜的制備、表征及應(yīng)用 分子印跡聚合物(MIP)具有特異識別目標(biāo)物的優(yōu)勢，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，抗惡劣環(huán)境能力強，以其作為SPR傳感器的識別元件，可以集分離、富集及檢測為一體，再引入納米金作為信號放大材料，初步構(gòu)建納米金信號放大的MIP-SPR傳感系統(tǒng)：將十一巰基烷酸(MUA)修飾的納米金加入預(yù)聚合液中，采用旋涂引發(fā)劑法，在SPR芯片表面原位聚合孔雀石綠(MG)的MIP膜及非印跡聚合物(NIP)膜。AFM表征結(jié)果表明，含有納米金的MIP膜厚度為56nm，可以用作SPR敏感識別元件。研究了不同膜對不同濃度MG的吸附響應(yīng)，結(jié)果顯示，含有納米金的MIP膜的SPR響應(yīng)信號最大增加了一倍，成功實現(xiàn)信號放大。用納米金信號放大的MIP-SPR傳感系統(tǒng)檢測MG，線性回歸方程為Y=0.03X+6.15，r=0.9927。水樣加標(biāo)回收率為84%-110%。 2、基于納米金標(biāo)記的二抗信號放大的SPR免疫傳感技術(shù)研究 生物抗體具備高特異性和高親和力的特點，可以提高檢測靈敏度和特異性，我們將免疫分析技術(shù)與SPR聯(lián)用，并通過引入納米金標(biāo)記的二抗進(jìn)行信號放大，從而進(jìn)一步提高檢測靈敏度。以阿特拉津(AT)為靶標(biāo)，經(jīng)過優(yōu)化AT-OVA的固定化濃度、AT-mAb的使用濃度、再生液、再生時間、二抗的加入方式、種類及用量等條件，初步建立了用于檢測AT的納米金標(biāo)記二抗信號放大的SPR免疫傳感方法，該方法最低檢出限為0.72ng/mL，檢測范圍2.18-629.06ng/mL，與未經(jīng)信號放大的SPR免疫檢測方法(最低檢出限為2.34ng/mL，檢測范圍6.4-188.0ng/mL)相比，檢出限更低，檢測范圍更寬，有效地改善了檢測靈敏度。方法特異性實驗表明，除撲草凈外，結(jié)構(gòu)功能類似物三聚氰胺，毒死蜱和2,4-D的抑制率均低于0.05，顯示出良好的特異性。用該方法檢測AT模擬水樣，加標(biāo)回收率為83~95%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)低于5%。利用HPLC法進(jìn)行方法比對，結(jié)果顯示，納米金標(biāo)記的二抗信號放大的SPR免疫傳感方法具有更高的靈敏度，更低的檢出限。而且，該方法不會受樣品體系本身性質(zhì)如顏色和離子強度的影響，不需要進(jìn)行樣品前處理，適用于痕量AT的直接檢測。此外，所有的試劑可以一步加入到檢測體系中，免去了費時的孵育過程。 3、基于磁顆粒信號放大的SPR免疫傳感技術(shù)研究 為了解決復(fù)雜樣品基質(zhì)前處理過程繁瑣的問題，將磁納米材料引入SPR檢測體系，既可以作為前處理材料進(jìn)行樣品的分離、富集，又可以放大SPR傳感信號，提高檢測靈敏度。采用EDC/NHS活化法，把AT-mAb偶聯(lián)到羧基修飾的磁納米顆粒(MNP)表面，并優(yōu)化AT-mAb及MNP的用量。將制備好的AT-mAb-MNP用于SPR傳感體系，經(jīng)優(yōu)化結(jié)合時間、AT-mAb-MNP的使用濃度后，初步建立了用于檢測AT的SPR間接競爭免疫傳感方法，繪制了工作曲線，線性回歸方程為Y=-0.0743+0.2397X，r=0.9924，IC50為74.77ng/mL，檢測范圍0.89-6309.57ng/mL，擴大了檢測范圍，信號放大效果明顯。 本研究基于分子印跡技術(shù)和免疫分析技術(shù)，分別考察納米金、納米金標(biāo)記的二抗、磁納米顆粒等材料對SPR傳感信號的放大作用，初步建立了納米金-MIP-SPR傳感平臺、納米金標(biāo)記的二抗-SPR及抗體-MNP-SPR免疫傳感平臺，并用于小分子農(nóng)獸藥殘留的檢測，結(jié)果表明，信號放大材料的引入可有效改善檢測靈敏度，擴大檢測范圍，上述平臺經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化和改良，有望為其他相關(guān)研究領(lǐng)域，如環(huán)境監(jiān)測、生物工程、臨床醫(yī)學(xué)、藥物分析等提供高靈敏度、低檢測限的分析手段，具有很好的實用價值和應(yīng)用前景。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R155.5
【部分圖文】：

作為信號放大材料，提高檢測靈敏度；實現(xiàn)對樣品中農(nóng)獸藥殘留的分離、富集和痕量檢測。信號放大的 SPR 免疫傳感系統(tǒng)的構(gòu)建，具有前處理過程簡便、高效，檢測靈敏度高的優(yōu)勢，是此類傳感技術(shù)應(yīng)用研究的重要探索，對促進(jìn)農(nóng)獸藥殘留檢測技術(shù)向著快速、靈敏、特異、簡便的方向發(fā)展具有重要意義，在環(huán)境監(jiān)測、食品安全、衛(wèi)生檢測、藥物分析、臨床檢驗等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。（二）研究內(nèi)容及技術(shù)路線本課題的研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面：1. 基于納米金信號放大的分子印跡聚合膜的制備及表征2. 基于納米金標(biāo)記的二抗信號放大的 SPR 免疫傳感檢測方法的研究3. 基于磁顆粒信號放大的 SPR 免疫傳感檢測方法的研究技術(shù)路線如下：

（3）將旋涂了引發(fā)劑的 SPR 芯片浸入預(yù)聚合液中，繼續(xù)通氮氣 5 min，密封稱量瓶，置于真空烘箱中，60oC 聚合 16 h。聚合完畢后將 SPR 芯片浸入甲醇:冰乙酸=9:1(v/v)的混合溶液，洗脫模板分子，每次 30 min，洗脫 10 次。不加 MG，按同樣方法制備含有納米金的 NIP 膜。

圖 2-2 納米金的紫外吸收光譜圖2. 聚合膜的表征本課題組在前期工作中，通過旋涂引發(fā)劑，在 SPR 芯片表面成功制備了 M薄膜。與接枝引發(fā)劑[85,86]的方法相比，旋涂引發(fā)劑法制備的膜，厚度均勻，吸大，且實驗步驟減少，時間大大縮短（至少省去 4h）。因此，在本研究中，繼用該方法，并將納米金加入預(yù)聚合液中，制備含有納米金的聚合物膜。用 A SEM 分別表征所得的 MIP 膜、NIP 膜及旋涂引發(fā)層。從 AFM 結(jié)果可知(圖 2含納米金的 MIP 膜厚度約為 47 nm，含有納米金的 MIP 膜厚度約為 56nm。根R 手冊[87]內(nèi)容顯示，由自由電子振動(消逝波)產(chǎn)生的電場的振幅，在金屬與絕質(zhì)的界面最強，然后隨著與金屬表面距離的增加呈指數(shù)級衰減，在接近 300nm乎衰減為 0。這表明，在越接近金屬與絕緣介質(zhì)界面處，共振效應(yīng)的靈敏度越此，本研究所制備的 MIP 膜厚度適宜，可以用作 SPR 傳感識別元件。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張雪英;;固相萃取——高效液相色譜法測定水中阿特拉津[J];水利科技與經(jīng)濟;2010年06期

2 李清波,黃國宏,劉孝義,趙秋;阿特拉津薄層層析檢測方法[J];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2002年02期

本文編號：2824186