目的:稀土元素(rare earth element,REE)以其獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)在我國農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等多個領(lǐng)域得到日益廣泛的應(yīng)用,由此越來越多的REE通過不同途徑進入環(huán)境,并通過呼吸道或食物鏈進入人體且在組織器官中蓄積。REE非機體必需元素,達到一定劑量后可引起多臟器和多系統(tǒng)的損害。因此,REE引發(fā)的環(huán)境殘留和累積對生態(tài)以及人體健康的影響已成為不容忽視的衛(wèi)生學(xué)問題。中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)對于REE的毒性異常敏感,流行病學(xué)調(diào)查和動物試驗研究均顯示,REE可影響CNS發(fā)育,損害學(xué)習(xí)與記憶能力。鑭是輕稀土元素的代表,其神經(jīng)發(fā)育毒性機制尚不明確,目前認為可能與干擾腦內(nèi)微量元素(鈣和鋅)、酶和神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)平衡,以及誘發(fā)氧化應(yīng)激有關(guān)。研究表明,鑭可以跨越血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)并在腦部蓄積,且以海馬和大腦皮質(zhì)為主。胎兒和生后早期的BBB功能尚不完善,這使得外源性環(huán)境毒物進入腦中的機會增大,造成CNS功能障礙。故推測,一方面生后早期未發(fā)育成熟的BBB給鑭進入腦組織提供了機會;另一方面,鑭可能破壞BBB緊密連接(tight junctions,TJs)使其發(fā)生滲漏,致使更多的鑭進入腦組織而在其中蓄積,影響神經(jīng)細胞的增殖和分化以及突觸結(jié)構(gòu)與功能,造成神經(jīng)發(fā)育障礙。BBB是存在于CNS與系統(tǒng)循環(huán)之間的多細胞血管結(jié)構(gòu),在維持CNS內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),保證神經(jīng)元功能正常運行上具有重要作用。BBB的屏障特性主要由腦微血管內(nèi)皮細胞間的連接復(fù)合體決定,包括TJs和粘附連接(adherens junctions,AJs),前者負責(zé)限制親水性分子的細胞旁通透,后者促進TJs的形成與維持。目前認為,細胞旁通透性的高低主要通過連接復(fù)合體的變化(連接蛋白的磷酸化、表達和重分布)和細胞骨架重排(actin-myosin收縮)來調(diào)控�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metal oproteinase,MMPs)是一組鋅依賴的肽鏈內(nèi)切酶,可以直接降解TJ蛋白和血管外基底膜而增高BBB通透性,其中明膠酶(MMP-2和-9)是主要參與者;Rho GTPases成員Rho A與其下游效應(yīng)器分子ROCK的激活,促進actin-myosin收縮和應(yīng)力纖維形成,與BBB細胞旁通透性增高密切相關(guān)。TJs破壞所致BBB通透性增高是多種重金屬(鉛、鋁、鎘)神經(jīng)毒性的重要靶點,但目前鑭對BBB通透性及TJs的影響尚未見報道。本研究通過對大鼠自出生日起至斷乳后一個月進行氯化鑭(lanthanum chloride,LaCl_3)飲水染毒,建立亞慢性LaCl_3暴露動物模型,利用形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、免疫熒光組織化學(xué)等實驗技術(shù),探討LaCl_3對生長發(fā)育期大鼠BBB細胞旁通透性的影響,與連接蛋白改變和細胞骨架重排的關(guān)聯(lián),以及MMP-2/-9和RhoA/ROCK信號通路活化狀態(tài)在其中起到的作用,為深入闡明鑭的神經(jīng)發(fā)育毒性機制、有效預(yù)防鑭所致認知功能缺陷提供新的線索和實驗證據(jù)。研究方法:健康成年Wistar大鼠60只(雌雄比例2:1),體重240±10g,由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物室內(nèi)保持溫度22±1℃,相對濕度50±5%,12h晝/夜環(huán)境。隨機將雌鼠分為對照組和低、中、高劑量染鑭組,按照雌雄比例2:1進行交配,次日晨發(fā)現(xiàn)陰栓或陰道分泌物鏡檢查出精子者視為受孕成功,記為妊娠0 d。產(chǎn)仔后對照組孕鼠飲用蒸餾水,染鑭組孕鼠分別飲用含0.25%、0.5%和1.0%LaCl_3的蒸餾水溶液。各組仔鼠在斷乳前經(jīng)由母乳染鑭,斷乳后則通過自由飲用相應(yīng)濃度的LaCl_3蒸餾水溶液染鑭,至斷乳后1個月結(jié)束,進行各項指標(biāo)測定。第一部分:采用Evans blue滲透實驗定量評價BBB通透性,透射電鏡觀察BBB超微結(jié)構(gòu)改變,免疫熒光組織化學(xué)法與Western blot法檢測BBB連接蛋白表達,Real-Time PCR法檢測BBB連接蛋白mRNA表達,闡明LaC l_3對仔鼠BBB通透性及連接復(fù)合體蛋白表達與mRNA轉(zhuǎn)錄的影響;第二部分:采用原位明膠酶譜法檢測腦MMP-2/-9活性,Western blot法檢測腦MMP-2/-9蛋白表達,Real-Time PCR法檢測腦MMP-2/-9及其內(nèi)源性抑制劑TIMP-2/-9 mRNA表達,探討MMP-2/-9在LaCl_3誘導(dǎo)的BBB通透性增高和連接蛋白水平下調(diào)中的作用;第三部分:通過葡聚糖密度梯度離心提取仔鼠腦微血管;采用Pull-down法檢測腦微血管RhoA活性,Western blot法檢測腦微血管ROCK1/2、p-MYPT1、p-MLC2和MLC2,以及MLCK蛋白表達,探討肌球蛋白磷酸化與細胞骨架重排在LaCl_3所致BBB細胞旁通透性增高中的作用。結(jié)果:1、LaCl_3暴露對仔鼠血腦屏障通透性和超微結(jié)構(gòu)的影響。LaCl_3處理組大腦半球、皮質(zhì)和海馬中Evans blue滲出量均顯著增多,提示LaCl_3暴露使仔鼠血腦屏障通透性增高。LaCl_3暴露致使仔鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)改變,中劑量組基底膜小部分溶解,TJs致密度降低;高劑量組內(nèi)皮細胞外圍基底膜厚薄不均,有部分溶解,內(nèi)皮細胞間緊密連接不清晰,致密度下降,星形膠質(zhì)細胞足突輕度腫脹。2、LaCl_3暴露對仔鼠血腦屏障連接蛋白表達和mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。LaCl_3暴露對仔鼠大腦皮質(zhì)、海馬的TJs蛋白和AJs蛋白表達的影響趨勢基本一致,即支架蛋白ZO-1表達無明顯改變,跨膜蛋白claudin-5,occludin和VE-cadherin的表達均顯著降低;但對其mRNA轉(zhuǎn)錄水平卻影響不一,與對照組比較,低劑量組大腦皮質(zhì)occludin和ZO-1 mRNA水平稍有升高但差異不顯著,高劑量組大腦皮質(zhì)和海馬claudin-5和VE-cadherin mRNA水平明顯下調(diào)。3、LaCl_3暴露對仔鼠腦MMP-2/-9活性、表達及抑制劑TIMPs mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。LaCl_3處理組仔鼠腦MMP-2/-9活性顯著增高;大腦皮質(zhì)和海馬MMP-9蛋白表達顯著上調(diào),但MMP-2蛋白表達變化不明顯。同時,仔鼠大腦皮質(zhì)和海馬Mmp9 mRNA水平顯著增高,Timp1 mRNA水平均明顯下降,而Mmp2和Timp2 mRNA水平變化均不明顯。4、LaCl_3暴露對仔鼠腦微血管RhoA/ROCK信號通路及細胞骨架重排的影響。LaC l_3處理組仔鼠腦微血管GTP-RhoA/Total-Rho A比值顯著增大,RhoA活性增高。ROCK1和ROCK2蛋白表達均顯著上調(diào),且各組ROCK2相對水平均高于ROCK1,提示LaCl_3暴露可激活RhoA/ROCK信號通路;此外,下游效應(yīng)分子MYPT1和肌球蛋白MLC2的磷酸化水平均顯著增高,MLCK蛋白表達也明顯上調(diào),表明ROCK和MLCK共同介導(dǎo)了MLC2的磷酸化,致使細胞骨架重排。結(jié)論:1、發(fā)育期LaCl_3暴露損害大鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu),下調(diào)連接蛋白occludin蛋白表達,下調(diào)claudin-5和VE-cadherin蛋白表達和m RNA轉(zhuǎn)錄水平,致使血腦屏障通透性增高。2、發(fā)育期LaCl_3暴露增強大鼠腦MMP-2/-9活性,上調(diào)MMP-9的蛋白表達與mRNA轉(zhuǎn)錄水平,同時下調(diào)TIMP-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,改變MMP-9/TIMP-1平衡。3、發(fā)育期LaCl_3暴露可激活大鼠腦微血管RhoA/ROCK信號通路并上調(diào)Ca~(2+)/CaM依賴的MLCK蛋白表達,致使MLC2磷酸化水平增高,促進肌動蛋白細胞骨架重排。
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖 3.1 各組仔鼠腦實質(zhì) Evans blue 的滲出量過檢測大腦半球、皮質(zhì)及海馬 Evansblue 滲出量，定量評價 BBB通透性改變。lue 滲出量以 μg/g 組織重量表示。圖中數(shù)據(jù)代表 x SD ，n 6，與對照組比較，%組比較，# P<0.05；與 0.5%組比較，& P<0.05�；|暴露對仔鼠血腦屏障連接蛋白定位與表達的影響疫熒光組織化學(xué)法檢測仔鼠腦毛細血管連接蛋白的定位與表達。如圖示，緊密連接蛋白 claudin-5，occludin，ZO-1 和粘附連接蛋白 VE-cad表達于腦血管內(nèi)皮細胞，神經(jīng)細胞無表達，背景色較暗。對照組 4 種均較強，0.25% LaCl3組與對照組比較無明顯差別，0.5%和 1.0% -5， occludin 和 VE-cadherin 有不同程度的熒光減弱，但各組 ZO-1 熒明顯。

13圖 3.2 各組仔鼠血腦屏障超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察仔鼠腦前額葉皮質(zhì)血腦屏障毛細血管超微結(jié)構(gòu)，A-D 分別為對照、0.25%、0.5%和 1.0% LaCl3處理組。箭號指示緊密連接，箭頭指示基底膜，* 指示星形膠質(zhì)細胞終足，Scale bar = 1μm。

14圖 3.3.1 各組仔鼠腦 TJ 蛋白 claudin-5 的定位與表達 （200×）免疫熒光組織化學(xué)法檢測緊密連接蛋白 claudin-5 在仔鼠腦血管的定位與表達。綠色熒光（FITC）強度代表 claudin-5 蛋白在大腦皮質(zhì)毛細血管的表達，藍色熒光（DAPI）指示細胞核，Scale bar = 50 μm。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

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3 范廣勤,袁兆康,鄭輝列,劉志剛;兒童稀土暴露的健康效應(yīng)研究[J];衛(wèi)生研究;2004年01期

本文編號：2822689