目的:探究三氧化二砷(As_2O_3)暴露對小鼠肝臟的損傷作用及牛磺酸保護(hù)作用的分子機(jī)制。方法:本研究以C57BL/6J小鼠為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以HepG2為體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀57BL/6J小鼠經(jīng)As_2O_3暴露(0、1、2及4 mg/L)及�；撬�(250 mg/Kg)干預(yù)后,采用HE染色及油紅O染色法,觀察小鼠肝臟組織及脂肪變性及脂質(zhì)堆積的情況;應(yīng)用免疫熒光法,標(biāo)記肝巨噬細(xì)胞標(biāo)記標(biāo)記物F4/80,檢測肝巨噬細(xì)胞聚集情況;利用蛋白質(zhì)印跡法檢測小鼠肝組織炎癥、NLRP3炎癥小體和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;依據(jù)非酒精性脂肪性肝炎(NAS)評分系統(tǒng),判定As_2O_3暴露后非酒精性脂肪性肝炎得發(fā)生;利用透射電子顯微鏡,檢測并觀察As_2O_3暴露后小鼠肝組織自噬小體的改變;用免疫熒光法,檢測小鼠肝組織中caspase-1活化的情況。利用MTT法檢測As_2O_3對HepG2細(xì)胞的細(xì)胞增殖率的影響;應(yīng)用NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950,判定As_2O_3誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活與As_2O_3導(dǎo)致的細(xì)胞焦亡及脂質(zhì)堆積之間的關(guān)系;應(yīng)用組織蛋白酶B(CTSB)抑制劑CA-074 Me,確定CTSB在As_2O_3誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡當(dāng)中的作用;應(yīng)用自噬抑制劑3-MA,確定As_2O_3誘導(dǎo)的自噬與NLRP3炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡發(fā)生之間的關(guān)系;用�；撬犷A(yù)處理后,探究�；撬釋τ贏s_2O_3造成的非酒精性脂肪性肝炎的保護(hù)作用的分子機(jī)制。流式細(xì)胞術(shù)用于檢測As_2O_3暴露后HepG2細(xì)胞焦亡數(shù)目變化;利用蛋白質(zhì)印跡法檢測炎癥小體及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;應(yīng)用油紅O染色法,觀察As_2O_3暴露后HepG2細(xì)胞脂質(zhì)堆積的情況。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn):HE及油紅O染色結(jié)果表明,As_2O_3暴露后的小鼠肝臟發(fā)生脂肪變性,脂質(zhì)聚集增加。肝巨噬細(xì)胞表面標(biāo)記物F4/80免疫熒光染色及Western blot結(jié)果表明炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)水平隨著As_2O_3暴露劑量的升高而升高。NAS評分表明4 mg/L組小鼠肝臟發(fā)生非酒精性脂肪性肝炎。自噬相關(guān)蛋白LAMP-1、LC3及CTSB表達(dá)升高,p62表達(dá)水平降低,透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)As_2O_3暴露組出現(xiàn)明顯自噬小體及自噬溶酶體,說明As_2O_3暴露后小鼠肝組織自噬過程被激活;炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)及caspase-1蛋白表達(dá)均升高;肝組織切片active caspase-1熒光染色結(jié)果表明,小鼠肝細(xì)胞發(fā)生焦亡。�；撬岣深A(yù)組小鼠肝臟自噬水平、炎癥水平、炎癥小體激活情況及細(xì)胞焦亡情況均得到改善;NAS評分降低,但是脂肪變性及脂質(zhì)堆積情況并未得到改善。體外實(shí)驗(yàn):As_2O_3染毒后,HepG2細(xì)胞NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白(NLRP3、caspase-1 p20及IL-1βp17)表達(dá)升高;流式結(jié)果提示細(xì)胞焦亡百分比顯著增加;應(yīng)用NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950及CTSB抑制劑CA074 Me處理后,As_2O_3引起的炎癥小體激活被抑制,焦亡細(xì)胞百分比明顯下降;應(yīng)用自噬抑制3-MA處理后,CTSB及炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)明顯降低,焦亡細(xì)胞百分比顯著下降。牛磺酸干預(yù)后,HepG2細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白、炎癥小體相關(guān)蛋白表達(dá)均被抑制,焦亡細(xì)胞百分比明顯減少。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相一致的是,無論是應(yīng)用MCC950、CA074 Me、3-MA處理還是�；撬岣深A(yù)后,脂質(zhì)聚集增加的情況均未被改變。結(jié)論:As_2O_3暴露后,脂肪變性及脂質(zhì)聚集增加,同時(shí)誘導(dǎo)自噬水平上調(diào),胞漿CTSB水平增加,進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體,使得IL-1β成熟,細(xì)胞炎癥水平增加,發(fā)生細(xì)胞焦亡,最終導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝炎;�；撬嶂饕ㄟ^抑制炎癥水平而不是改善脂質(zhì)聚集,從而緩解As_2O_3造成的非酒精性脂肪性肝炎。
【學(xué)位單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

圖 2. �；撬峥梢砸种迫趸檎T導(dǎo)的自噬水平上調(diào)、NLRP3 炎癥小體激活以及細(xì)胞焦亡的發(fā)生（A）透射電鏡觀察小鼠肝組織細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)，觀察自噬小體及自噬溶酶體的變化。（B）蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測小鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)及統(tǒng)計(jì)分析。（C）蛋白質(zhì)免疫印跡法

圖 3. 三氧化二砷導(dǎo)致肝細(xì)胞焦亡依賴于 NLRP3 炎癥小體的激活（A）As2O3對 HepG2 細(xì)胞生存率的影響。（B）As2O3染毒后，HepG2 細(xì)胞 LDH 釋放率的改變。MCC950 干預(yù)后，NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)（C）及其統(tǒng)計(jì)分析、LDH 釋放率的改變（D）、細(xì)胞焦亡（E）及脂質(zhì)聚集（F）的變化。*表示與對照組相比 P<0.05；#表示

圖 4. CTSB 介導(dǎo)三氧化二砷誘導(dǎo)的 NLRP3 炎癥小體激活及細(xì)胞焦亡CA-074 Me 干預(yù)后，NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)（A）及其統(tǒng)計(jì)分析（B-D）、亡（E-F）及脂質(zhì)沉積（G-H）的變化。*表示與對照組相比P<0.05；#表示與染毒組相比P<0.

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王素琴;黃緣;;非酒精性脂肪肝病的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2014年23期

本文編號：2809780