發(fā)布時(shí)間：2020-08-28 03:03

【摘要】：飲用水氯化消毒必然會(huì)產(chǎn)生氯化消毒副產(chǎn)物(DBPs),鹵代苯醌(HBQs)是近年來(lái)在飲用水檢出的一類新型DBPs。前期研究表明HBQs的細(xì)胞毒性強(qiáng)于受控的鹵乙酸和三鹵甲烷,并能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基上升,從而導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷,提示HBQs有潛在遺傳毒性。然而,現(xiàn)有研究對(duì)HBQs的毒理學(xué)評(píng)價(jià)仍不完善,缺乏對(duì)HBQs致基因位點(diǎn)突變、DNA損傷和染色體畸變等多個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)的綜合評(píng)價(jià)。故本研究擬采用體外試驗(yàn)組合對(duì)HBQs的細(xì)胞毒性和遺傳毒性進(jìn)行研究,為將來(lái)HBQ的暴露風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)修訂提供科學(xué)數(shù)據(jù)。1 6種HBQs的細(xì)胞毒性研究目的:檢測(cè)6種HBQs暴露于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系細(xì)胞(CHO-K1)72h細(xì)胞毒性作用。方法:將1000個(gè)/孔細(xì)胞接種在96孔板中,培養(yǎng)24 h后,分別加入不同濃度的2,6-二氯-1,4-二氯苯醌(2,6-DCBQ)、2,5-二氯-1,4-二氯苯醌(2,5-DCBQ)、2,6-二溴-1,4-苯醌(2,6-DBBQ)、2,5-二溴-1,4-苯醌(2,5-DBBQ)、2,6-二碘-1,4-苯醌(2,6-DIBQ)和2,3-二碘-1,4-苯醌(2,3-DIBQ),并設(shè)0.5%DMSO為溶劑對(duì)照,染毒72 h后以酶標(biāo)儀于450nm測(cè)定吸光度并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率(%)。結(jié)果:6種HBQs對(duì)CHO-K1細(xì)胞毒性順位:2,3-DIBQ2,6-DIBQ2,6-DBBQ2,5-DBBQ2,5-DCBQ2,6-DCBQ。半數(shù)抑制劑量(IC_(50))數(shù)量級(jí)在10~-55 M;毒性較幾乎所有鹵代甲烷類DBPs毒性強(qiáng)、較絕大部分鹵乙酸類毒性強(qiáng),但比大部分鹵乙腈類DBPs毒性弱;IC_(50)與摩爾表面積(S)具有顯著相關(guān)性(P0.05),而與辛醇-水對(duì)數(shù)分配系數(shù)(logP)、最高已占軌道(E_(HOMO))、最低未占軌道(E_(LUMO))、偶極矩(μ)和摩爾折射率(R)無(wú)關(guān)(P0.05)。結(jié)論:HBQs對(duì)CHO-K1細(xì)胞毒性IC_(50)范圍為14.61μM~31.90μM,其細(xì)胞毒性大小與物質(zhì)的理化特性密切相關(guān)。2 6種HBQs的遺傳毒性研究目的:采用HPRT基因突變法、單細(xì)胞凝膠電泳(SCGE)試驗(yàn)、胞質(zhì)阻滯法微核(CBMN)試驗(yàn)評(píng)價(jià)6種HBQs對(duì)CHO-K1細(xì)胞的遺傳毒性作用。方法:將1×10~6個(gè)CHO-K1細(xì)胞接種于100 mm皿中,正常培養(yǎng)24 h后,分別加入6種不同濃度HBQs,陰性對(duì)照為DMSO,陽(yáng)性對(duì)照為甲基磺酸乙酯,處理4 h后回復(fù)培養(yǎng)20 h。收集細(xì)胞,采用HPRT基因突變法測(cè)定突變情況,加入5μg/mL 6-TG篩選突變體,計(jì)算突變率。CHO-K1細(xì)胞暴露于6種不同濃度HBQs,溶劑對(duì)照為DMSO,陽(yáng)性對(duì)照為EMS,24 h后采用SCGE試驗(yàn)測(cè)定尾部DNA%、尾長(zhǎng)和Olive尾距。加入5μg/mL細(xì)胞松弛素B和6種不同濃度HBQs對(duì)CHO-K1細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行染毒,并設(shè)溶劑對(duì)照(DMSO)和陽(yáng)性對(duì)照(絲裂霉素C),染毒1.5-2個(gè)細(xì)胞周期后計(jì)算微核率、核橋率和核芽率,并分析遺傳毒性大小與細(xì)胞毒性和理化結(jié)構(gòu)參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果:6種HBQs的突變率與溶劑對(duì)照相比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。隨著2,6-DCBQ染毒劑量升高,10μM即可導(dǎo)致尾部DNA%和尾長(zhǎng)顯著增加(P0.05),15μM 2,6-DCBQ可引起Olive尾距值升高(P0.05);1μM 2,5-DCBQ即可導(dǎo)致尾部DNA%、尾長(zhǎng)和Olive尾距值顯著增加(P0.05)。但隨著2,6-DCBQ和2,5-DCBQ染毒劑量升高,尾部DNA%、尾長(zhǎng)和Olive尾距又呈下降趨勢(shì)。其余4種HBQs SCGE試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、2,6-DIBQ和2,5-DCBQ可導(dǎo)致微核率、核芽率和核橋率顯著增加(P0.05),并隨劑量增加呈劑量反應(yīng)關(guān)系。其余2種HBQs CBMN試驗(yàn)結(jié)果呈陰性。遺傳毒性大小順位為:2,5-DCBQ2,6-DBBQ2,6-DIBQ2,6-DCBQ;HBQs的遺傳毒性效能與其細(xì)胞毒性有相關(guān)性(P0.05);與摩爾折射率R、辛醇-水分配系數(shù)logP、摩爾表面積S、最高已占軌道E_(HOMO)、最低未占軌道E_(LUMO)、偶極矩μ無(wú)相關(guān)(P0.05)。結(jié)論:CHO-K1/HPRT基因突變?cè)囼?yàn)表明6種HBQs無(wú)致突變性。CHO/SCGE試驗(yàn)表明2,6-DCBQ和2,5-DCBQ可能具有致DNA損傷的作用,未觀察到其余4種HBQs有DNA損傷作用。CHO-K1/CBMN試驗(yàn)表明2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、2,6-DIBQ和2,5-DCBQ具有染色體損傷作用,未觀察到其余2種HBQs有染色體損傷作用。其遺傳毒性順位為2,5-DCBQ2,6-DBBQ2,6-DIBQ2,6-DCBQ;與HBQs的細(xì)胞毒性相關(guān)。結(jié)合三種遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果表明HBQs為可疑遺傳毒物。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R114
【圖文】：

圖 1-1 6 種 HBQs 染毒 72 h 后對(duì) CHO-K1 細(xì)胞的毒性Figure 1-1 The cytotoxicity of six HBQs in CHO-K1 cells for 72 h表 1-1 HBQs 72 h 染毒后對(duì) CHO-K1 細(xì)胞的影響HBQs 細(xì)胞毒性范圍（μM） IC50（μM） R2細(xì)胞毒性排序2,3-DIBQ 0.6269 - 90.27 14.61 0.9850 12,6-DIBQ 0.8718 - 88.74 17.12 0.9745 22,6-DBBQ -1.262  80.38 21.58 0.9126 32,5-DBBQ 0.8275  86.5 24.82 0.9756 42,5-DCBQ 0.1976  81.75 26.39 0.9680 52,6-DCBQ 0.89 - 78.88 31.90 0.9920 6注：IC50表示與對(duì)照組比較，HBQs 引起半數(shù)細(xì)胞死亡的濃度；R2表示劑量-反應(yīng)曲線的確定系數(shù).2 四類 DBPs 對(duì) CHO 細(xì)胞 72 h 毒性比較參考其它三類消毒副產(chǎn)物 72 h 暴露于 CHO 細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用，用

細(xì)胞可形成邊界清晰、肉眼清晰可見的類圓形集落（圖2-1A），倒置顯微鏡低倍鏡下觀察每個(gè)集落均含 50 個(gè)以上的細(xì)胞（圖 2-1B）。圖 2-1 細(xì)胞集落形成情況A：六孔板中細(xì)胞集落形態(tài)；B：顯微鏡下細(xì)胞集落形態(tài), ×40Figure 2-1 Colony formation of cellsA: Cells colony morphology in a six well plate; B: Colony morphology in microscope, ×402.2 未經(jīng) S9 活化的 6 種 HBQs 的細(xì)胞毒性在無(wú) S9 情況下，6 種 HBQs 隨著染毒劑量的升高，細(xì)胞集落形成數(shù)和相對(duì)集落形成率均逐漸下降，呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。6 種 HBQs 染毒組的相對(duì)集落形成率與陰性對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。2,5-DBBQ和 2,3-DIBQ 能導(dǎo)致細(xì)胞相對(duì)集落形成率明顯下降的最小濃度為 12.5 μM，2,6-DCBQ、2,6-DBBQ 和 2,6-DIBQ 則均為 25 μM，而 2,5-DCBQ 為 50 μM。

圖 2-2 選擇表達(dá)后突變集落形成情況A：陰性對(duì)照 B：陽(yáng)性對(duì)照Figure 2-2 Selection of mutant colonies after expressionA: Solvent control B: Positive control表 2-5 6 種 HBQs 對(duì) HPRT 基因位點(diǎn)突變情況（-S9）HBQs 組別 集落數(shù)（個(gè)） 集落形成率（%）突變集落數(shù)（個(gè)）突變頻率/2×16-DCBQ 陰性對(duì)照 130.8 ±7.56 65.40 ±3.78 0 ±0 0 ±0陽(yáng)性對(duì)照 93.6 ±5.03 46.40 ±3.27 42.2 ±7.46 * 90.95 ±16.0825 μM 154.2 ±6.42 78.60 ±2.07 0 ±0 0 ±050 μM 140.2 ±8.44 69.60 ±3.71 0 ±0 0 ±075 μM 112.2 ±9.98 56.70 ±6.75 0 ±0 0 ±0100 μM 119.6 ±10.57 57.30 ±1.64 0 ±0 0 ±0

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本文編號(hào)：2807002