【摘要】：目的本實(shí)驗(yàn)建立巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞體外模型,將納米二氧化硅刺激的THP-1源性巨噬細(xì)胞上清作用于MRC-5,通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測(cè)MRC-5蛋白表達(dá)水平變化,探討納米二氧化硅對(duì)MRC-5蛋白表達(dá)的影響,為探索人體納米二氧化硅暴露導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和纖維化趨勢(shì)的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。方法常規(guī)培養(yǎng)THP-1和MRC-5細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)前預(yù)先用PMA將THP-1誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞。將THP-1源性巨噬細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和五個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)組,粉塵作用濃度分別為(0、6.25、12.5、25、50、100)μg/ml,作用時(shí)間為24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率,AnnexinV-FITC法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率,酶偶聯(lián)比色法和TBA法分別檢測(cè)細(xì)胞上清LDH和MDA水平。同樣將MRC-5隨機(jī)分為對(duì)照組和五個(gè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)組,分別加入相應(yīng)濃度處理組的巨噬細(xì)胞上清,作用時(shí)間為24h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增值率,樣本堿水解法檢測(cè)細(xì)胞上清Hyp的分泌水平,闡述納米二氧化硅對(duì)巨噬細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的損傷作用,評(píng)價(jià)體外模型構(gòu)建是否成功。選取巨噬細(xì)胞上清對(duì)MRC-5毒性作用最明顯的一組,使用液相-質(zhì)譜儀對(duì)該組和對(duì)照組細(xì)胞蛋白進(jìn)行定性、定量分析,篩選兩組間的差異蛋白。選取其中有代表性的蛋白經(jīng)蛋白免疫印跡法驗(yàn)證差異性,評(píng)價(jià)質(zhì)譜結(jié)果的可靠性。其中,對(duì)細(xì)胞存活率、增值率等常規(guī)實(shí)驗(yàn)均設(shè)立相同濃度梯度的微米二氧化硅處理組作為納米作用強(qiáng)度的陽(yáng)性對(duì)照,差異蛋白檢測(cè)僅針對(duì)納米二氧化硅實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果1透射電鏡結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)所用納米顆粒粒徑在20~50nm之間;粉塵粒度儀結(jié)果顯示,無(wú)血清RMPI1640培養(yǎng)基中納米顆粒輕微團(tuán)聚,平均粒徑為166.8nm。2倒置顯微鏡下觀(guān)察,納米組的巨噬細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞變圓、細(xì)胞膜皺縮、胞質(zhì)內(nèi)產(chǎn)生空泡甚至破裂死亡等變化,隨著粉塵濃度的升高,胞質(zhì)內(nèi)顆粒物沉積量增加,細(xì)胞貼壁狀態(tài)變差。3 MTT法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的存活率:納米組巨噬細(xì)胞存活率在粉塵濃度為6.25μg/ml時(shí)較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各組均較對(duì)照組低(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為6.25、12.5、25μg/ml時(shí)細(xì)胞存活率低(P0.05),其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。4 Annexin V-FITC法檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡水平:納米組各劑量組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組均高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為6.25、25μg/ml時(shí)細(xì)胞凋亡率高(P0.05),其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。5酶偶聯(lián)比色法檢測(cè)細(xì)胞上清LDH分泌水平:納米組巨噬細(xì)胞上清LDH含量在粉塵濃度為6.25μg/ml時(shí)較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各組細(xì)胞上清LDH含量均較對(duì)照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在粉塵濃度為25、50、100μg/ml時(shí)巨噬細(xì)胞上清的LDH活力高(P0.05),其余各組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6 TBA法檢測(cè)細(xì)胞上清MDA分泌水平:納米組細(xì)胞上清MDA含量在粉塵濃度為6.25μg/ml時(shí)較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余組細(xì)胞上清MDA含量較對(duì)照組上升(P0.05);與同濃度微米組相比,納米各處理組MDA活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。7 MTT法檢測(cè)MRC-5的增值率:納米組在粉塵濃度為6.25μg/ml時(shí)細(xì)胞增值率較對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余組細(xì)胞增值率較對(duì)照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,納米組在12.5μg/ml時(shí)細(xì)胞增值率高(P0.05),其余各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8樣本堿水解法檢測(cè)MRC-5上清Hyp的分泌水平::納米組在粉塵濃度為6.25、12.5μg/ml時(shí)細(xì)胞上清Hyp含量與較照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其余各組上清Hyp含量較對(duì)照組高(P0.05);與同濃度微米組相比,粉塵濃度為100μg/ml時(shí)納米組MRC-5上清Hyp含量高(P0.05),其余各組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。9液相-質(zhì)譜儀檢測(cè)差異蛋白,western-blot法檢測(cè)差異蛋白:經(jīng)檢測(cè)分析,兩組樣品共檢測(cè)蛋白質(zhì)3174個(gè),其中差異蛋白234個(gè)。差異蛋白主要富集在核糖體通路,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)與分化,監(jiān)督蛋白正確折疊,對(duì)外源性刺激產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)等生物過(guò)程;選擇表達(dá)上調(diào)的蛋白中與其他蛋白相互作用明顯且有代表性的P4HB和HSP90B1蛋白進(jìn)行驗(yàn)證差異蛋白的實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組兩種目的蛋白較對(duì)照組表達(dá)均高(P0.05),驗(yàn)證了質(zhì)譜結(jié)果的可靠性。結(jié)論1納米二氧化硅可降低THP-1源性巨噬細(xì)胞的存活率,導(dǎo)致細(xì)胞損傷并發(fā)生凋亡作用,在相應(yīng)濃度作用強(qiáng)度大于微米二氧化硅。2納米二氧化硅作用于巨噬細(xì)胞誘發(fā)其分泌的細(xì)胞因子可引起MRC-5增值和Hyp分泌量增加,在相應(yīng)濃度作用強(qiáng)度大于微米二氧化硅。3納米二氧化硅作用于巨噬細(xì)胞誘發(fā)其分泌的細(xì)胞因子可引起MRC-5發(fā)生蛋白水平的改變,調(diào)控細(xì)胞凋亡、蛋白合成及細(xì)胞生長(zhǎng)等生物過(guò)程。其中,SerpinB2蛋白可能是人體肺成纖維細(xì)胞暴露于納米二氧化硅顆粒引起炎癥反應(yīng)和纖維化趨勢(shì)的生物標(biāo)志物。圖10幅;表10個(gè),參115篇。
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R114
【圖文】：

圖 1 納米二氧化硅顆粒透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron micrograph of nano-silica parti

圖 2 納米二氧化硅顆粒在無(wú)血清 RMPI1640 培養(yǎng)基中粒度分布圖Fig. 2 Particle size distribution of nano-silica particles in serum-free RMPI1640 medium1.5.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變（1）THP-1 細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)鏡下呈大小均一，折光度好，透明無(wú)顆粒的圓形懸

A THP-1 細(xì)胞 B THP-1 源性巨噬細(xì)胞圖 3 THP-1 細(xì)胞和 THP-1 源性巨噬細(xì)胞形態(tài)（×100）Fig. 3 THP-1 cells and THP-1 derived macrophage morphology（×100）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2799685