【摘要】：研究背景不孕不育是社會廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生問題,大約影響了全世界8-12%的育齡夫婦,并且有40-50%可能是由于“男性因素”造成的不育,其中精子數(shù)量和質(zhì)量降低是男性不育最主要的原因。研究表明,許多環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)都能造成人和動物的生殖系統(tǒng)損傷,并降低男(雄)性的精子質(zhì)量。三氯生(TCS)是一種廣泛用于個人洗護(hù)用品和臨床消毒的酚類廣譜抗菌劑,被認(rèn)為是潛在的EEDs。精子的產(chǎn)生是一個高度有序的過程,依賴于睪丸生殖細(xì)胞增殖、分化和死亡之間的平衡調(diào)節(jié),自噬是不同于凋亡的一種細(xì)胞死亡形式,適度的自噬能促進(jìn)精子的分化和成熟,保護(hù)生精細(xì)胞免受有害條件的侵害,超過細(xì)胞承受能力的自噬將誘導(dǎo)細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡。本課題組選取10對精液質(zhì)量異常的病例組和正常對照組的精液樣本,通過自噬功能基因芯片和相關(guān)文獻(xiàn)報道,篩選出可能與TCS相關(guān)并導(dǎo)致精液質(zhì)量降低的CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四個自噬基因,目前,TCS是否通過細(xì)胞自噬導(dǎo)致生殖損傷尚未見報道,本文旨在探討TCS暴露通過自噬基因的調(diào)控作用導(dǎo)致生殖損傷的可能機制。材料與方法第一部分:自噬基因的篩選及人群驗證。研究對象選自2016年6月至2017年9月期間在深圳市某三甲醫(yī)院生殖中心進(jìn)行精液檢查的男性,收集其精液樣本、精液常規(guī)結(jié)果和問卷信息。方法:1.選取精液質(zhì)量異常和和精液質(zhì)量正常的受試對象各10例,進(jìn)行精液自噬基因芯片檢測,并結(jié)合文獻(xiàn)報道與EEDs作用機制相關(guān)的基因,篩選出可能與TCS相關(guān)并導(dǎo)致精液質(zhì)量降低的自噬基因。2.采用成組設(shè)計的病例對照的研究方法,選取精液質(zhì)量異常的病例104例,精液質(zhì)量正常的對照250例,采用Trizol法提取精液總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,qPCR的對上述差異表達(dá)基因進(jìn)行驗證。第二部分:TCS經(jīng)口暴露的動物實驗。用TCS對8周齡的SD大鼠進(jìn)行經(jīng)口暴露染毒,以未觀察到有害作用水平(NOAEL=50mg/kg/d)為中等暴露劑量,設(shè)計暴露劑量梯隊。在空白組、玉米油溶劑對照組(1Omg/kg)、低劑量組(10mg/kg)、中劑量組(50mg/kg)和高劑量組(250mg/kg)五個實驗組中,觀察睪丸組織損傷和相關(guān)自噬基因的表達(dá)。方法:3.用HE染色,透射電鏡方法觀察睪丸組織的病理損傷。4.用免疫組織化學(xué)、qPCR和蛋白印跡技術(shù)對篩選的自噬相關(guān)基因進(jìn)行檢測。結(jié)果1.自噬基因芯片篩選中,與對照組相比,在84個自噬相關(guān)功能基因中,有18個自噬基因表達(dá)差異倍數(shù)大于2且全部表達(dá)下調(diào),結(jié)合文獻(xiàn)報道,最終篩選出CXCR4、ESR1、PTEN和LC3B四個可能與TCS相關(guān)并導(dǎo)致精液質(zhì)量降低的自噬基因。2.在人群驗證中,相對于對照組,ESR1基因在病例組表達(dá)顯著下降(P0.05),CXCR4、PTEN和LC3B在病例組均有下降趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)意義。3.TCS暴露組中,HE染色結(jié)果顯示:睪丸曲細(xì)精管發(fā)生損傷,出現(xiàn)空泡樣改變,精子減少,各劑量組具有劑量-反應(yīng)關(guān)系。透射電鏡同樣發(fā)現(xiàn)了 HE染色顯示的組織損傷,同時發(fā)現(xiàn)成熟的自噬溶酶體結(jié)構(gòu)、線粒體和高爾基體出現(xiàn)腫脹和空泡。4.免疫組化結(jié)果顯示,LC3B在空白組和溶劑對照組中,只有少量淺黃色顆粒,而在低、中和高劑量組中呈現(xiàn)大量棕黃色顆粒,并隨著劑量增加遠(yuǎn)離曲細(xì)精管管腔分布。CXCR4,ESR1和PTEN在各組間沒有差異;與對照組相比,qPCR結(jié)果顯示LC3B基因表達(dá)在病例組中表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05);蛋白印跡結(jié)果顯示,LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值在低劑量組和中劑量組表達(dá)升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論1.自噬相關(guān)基因ESR1在人群精液中的低表達(dá),可能與精液質(zhì)量降低有關(guān)。2.TCS暴露導(dǎo)致大鼠睪丸曲細(xì)精管損傷,生精細(xì)胞脫落和減少,表明TCS具有一定的生殖毒性。3.TCS暴露使雄性大鼠睪丸組織LC3B基因mRNA水平、LC3B-Ⅱ蛋白和LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白比值升高,提示自噬可能參與了TCS致大鼠睪丸組織損傷的過程。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R114
【圖文】：

大部分人都處于廣泛而長期的ＴＣＳ暴露之中ｔ１９，２Ｇ］。逡逑ＴＣＳ的芳香特性和高氯含量使其能夠抵抗降解并在環(huán)境中持續(xù)存在（ＴＣＳ逡逑結(jié)構(gòu)見圖１－１），一方面，ＴＣＳ在地表水，土壤，沉積物和水生物種中都有檢測逡逑到［２１］。在美國，高達(dá)５７．６％的溪流和河流中均能檢測到ＴＣＳ，ＴＣＳ被列為美國河逡逑流中能檢測到的前１０名的污染物［２２￣２３］；在新加坡，城市集水區(qū)ＴＣＳ檢測率為逡逑１００％邋（最高濃度為６１ｎｇ／Ｌ），覆蓋了新加坡約六分之一的陸地面積［２４］；在巴逡逑西圣保羅的河流中，１＾：５的檢測濃度為２．２－６６１１＆／１；２５］；在中國珠江水系的地表逡逑水和沉積物中，ＴＣＳ的濃度分別為１１－４７８叩／１＾和５０－１３３0１＾４￥氣同時，也逡逑有證據(jù)表明，由于受到污染的廢水或肥料的影響，農(nóng)業(yè)食物的供應(yīng)也可能受到了逡逑ＴＣＳ的污染另一方面，ＴＣＳ在人體各種體液和組織樣本中都有檢出，包括逡逑尿液、血液

逑嗤主要包括巨自嗤（Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐａｈｇｙ）、微自嗟（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）和分子伴侶介導(dǎo)逡逑的自嗤（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄａｕｔｏｐｈａｇｙ，ＣＭＡ）三種形式，見圖１－２。我們通常說逡逑的自噬指的是“巨自噬”，也是自噬領(lǐng)域目前研究最多的一種形式，主要針對于逡逑可溶性大分子物質(zhì)和受損細(xì)胞器的降解。在自噬過程中，細(xì)胞首先形成雙層或多逡逑層膜結(jié)構(gòu)的吞噬泡（Ｐｈａｇｏｐｈｏｒｅ），吞噬泡一般來源于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體逡逑膜結(jié)構(gòu)；吞嗤泡包裹著待降解的細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞器形成自嚼體（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ）；逡逑隨后自嗤體和溶酶體發(fā)生融合，形成自嗤溶酶體（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｌｙｓｏｓｏｍｅ），最后，逡逑溶酶體通過各類水解酶將自噬溶酶體中包裹的物質(zhì)降解，促進(jìn)細(xì)胞更新代謝。微逡逑自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬主要針對于小分子可溶性物質(zhì)的降解，微自噬主要逡逑通過溶酶體膜自身內(nèi)陷包裹待降解物質(zhì)，在溶酶體內(nèi)完成自噬降解，整個過程沒逡逑有自噬體的形成；ＣＭＡ是一種非常復(fù)雜和特異的途徑

３．２結(jié)果逡逑３．２．１邋ＴＣＳ染毒大鼠睪丸組織ＨＥ染色結(jié)果逡逑如圖３－１所示，ＴＣＳ暴露后大鼠睪丸曲細(xì)精管ＨＥ染色結(jié)果。其中，空白組逡逑（Ｂｌａｎｋ）和對照組（Ｃｏｎｔｒｏｌ）都能夠觀察到正常的睪丸結(jié)構(gòu)和完整的曲細(xì)精管，逡逑包括最外層的精原細(xì)胞和支持細(xì)胞，中間層的精母細(xì)胞，最內(nèi)層的精子細(xì)胞及精逡逑子，并且各級生精細(xì)胞和支持細(xì)胞排列緊密。逡逑３７逡逑

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本文編號：2797452