【摘要】：1-溴丙烷(1-Bromopropane,1-BP)是常用的工業(yè)有機(jī)溶劑,近年來(lái)被廣泛用作臭氧層消耗物質(zhì)(Ozone depleting substance,ODS)的替代劑及干洗劑。我國(guó)是1-BP主要生產(chǎn)和出口國(guó),隨著《蒙特利爾議定書(shū)》的執(zhí)行,國(guó)內(nèi)應(yīng)用也逐年增加,目前我國(guó)1-BP職業(yè)接觸人群呈快速上升趨勢(shì)。1-BP具有神經(jīng)毒性,除來(lái)自美國(guó)和日本的中毒病例外,近年我國(guó)1-BP中毒病例逐漸見(jiàn)諸報(bào)道,2013年溴丙烷中毒納入了我國(guó)新版《職業(yè)病分類(lèi)和目錄》。目前報(bào)道的1-BP中毒病例均是因嚴(yán)重周?chē)窠?jīng)損傷住院治療的病人,這些病人多表現(xiàn)為站立、行走困難、甚至癱瘓。迄今,1-BP周?chē)窠?jīng)毒性機(jī)制不清楚,無(wú)特效治療藥物,神經(jīng)損傷很難完全恢復(fù)。一般認(rèn)為神經(jīng)毒性有機(jī)溶劑多直接損傷神經(jīng)軸突,但基于1-BP中毒病人的癥狀、體征、預(yù)后及腓腸神經(jīng)活檢推測(cè)1-BP可能導(dǎo)致了神經(jīng)元損傷,而非僅僅軸索毒性。有研究觀察到1-BP可導(dǎo)致大鼠小腦顆粒細(xì)胞、浦肯野細(xì)胞變性死亡,伴隨小腦星型膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞激活及氧化應(yīng)激。我們先前也觀察到1-BP可導(dǎo)致大鼠前額葉和海馬區(qū)域神經(jīng)炎癥,伴隨神經(jīng)元丟失和認(rèn)知功能障礙,但1-BP染毒是否導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷,并與1-BP周?chē)窠?jīng)毒性相關(guān),迄今尚未見(jiàn)報(bào)道。研究顯示,1-BP進(jìn)入體內(nèi)代謝復(fù)雜,主要經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P4502E1(Cytochrome P4502E1,CYP2E1)代謝并產(chǎn)生多種氧化代謝產(chǎn)物,但這些活性代謝產(chǎn)物極性強(qiáng),難以經(jīng)受長(zhǎng)距離的運(yùn)輸和透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)。作為有機(jī)溶劑,1-BP本身極易進(jìn)入大腦,1-BP的神經(jīng)毒性是否因腦內(nèi)1-BP在大腦原位經(jīng)CYP2E1代謝產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物所致?因此,本課題分別采用臨床上能夠清除大腦自由基的依達(dá)拉奉(Edaravone,EDV)和CYP2E1特異性抑制劑烯丙基硫(Allyl sulfide),通過(guò)抗氧化和抑制1-BP經(jīng)CYP2E1氧化代謝,觀察是否能夠抑制或減輕1-BP的周?chē)窠?jīng)毒性,改善其神經(jīng)功能。并探討了 1-BP導(dǎo)致周?chē)窠?jīng)毒性的早期事件、關(guān)鍵調(diào)控分子和傳播機(jī)制,以期發(fā)現(xiàn)有效干預(yù)和治療的針對(duì)性靶點(diǎn),為接觸人群保護(hù)措施的制定和完善提供可靠數(shù)據(jù);同時(shí)也為其它有機(jī)溶劑的神經(jīng)毒性研究提供可借鑒的思路和依據(jù)。第一部分自由基清除劑依達(dá)拉奉對(duì)1-溴丙烷誘導(dǎo)大鼠周?chē)窠?jīng)毒性的影響研究目的1-BP能夠引起大腦氧化損傷,EDV是一種強(qiáng)效的自由基清除劑,臨床上應(yīng)用于治療腦缺血性卒中(Cerebral ischemic stroke,CIS)和腦缺血再灌注引起的氧化損傷。實(shí)驗(yàn)室研究也觀察到EDV對(duì)肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)和帕金森病(Parkinson's disease,PD)等多種慢性神經(jīng)退行性病變動(dòng)物模型有明顯的改善作用,與抑制自由基引起的氧化損傷,減輕下游神經(jīng)炎癥和神經(jīng)元丟失密切相關(guān)。因此,本研究采用EDV作為抗氧化劑,觀察了 EDV對(duì)1-BP誘導(dǎo)周?chē)窠?jīng)損傷的影響,以探討1-BP的氧化損傷機(jī)制在其周?chē)窠?jīng)毒性中的作用。研究方法1.1動(dòng)物分組及處理:72只SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠,體重180-220 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組、200 mg/kg.bw 1-BP組、400 mg/kg.bw 1-BP組、800 mg/kg.bw 1-BP組、800 mg/kg.bw 1-BP+EDV干預(yù)組及EDV對(duì)照組,每組12只。經(jīng)腹腔注射給予6 mg/kg.bw的EDV,4小時(shí)后,1-BP分別按照不同劑量灌胃染毒,每天一次,每周7天,連續(xù)6周。每周檢測(cè)各組大鼠后肢抓力評(píng)價(jià)周?chē)窠?jīng)損傷。1.2各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察:大鼠經(jīng)體內(nèi)灌注固定后,取大腦。分別經(jīng)后固定和蔗糖脫水后,制備冠狀冰凍切片,采用硫堇染色觀察運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)尼氏體密度評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷情況;采用免疫組織化學(xué)染色,觀察各組大鼠運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷及數(shù)量變化,觀察小膠質(zhì)細(xì)胞及星型膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況,采用免疫雙熒光染色檢測(cè)神經(jīng)元凋亡情況。1.3大腦生化指標(biāo)檢測(cè):采用生化檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)一氧化氮(Nitric oxide,NO)含量及一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase,NOS)活性,反應(yīng)大腦氮化應(yīng)激狀態(tài)。1.4 Western blot檢測(cè)大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá):采用Western blot分別檢測(cè)了神經(jīng)元特異性核蛋白(Neuron specific nuclear protein,NeuN)、小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白-離子鈣接頭蛋白分子1(Ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba-1)、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白-膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(Cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)、硫氧還蛋白 1(Thioredoxin 1,Trx1)、凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)及磷酸化ASK1(Thr 845)、p38及磷酸化p38、3-硝基酪氨酸(3-Nitrotyrosine,3-NT)的相對(duì)蛋白表達(dá)量,觀察評(píng)價(jià)膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)元凋亡及相關(guān)凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路激活情況。結(jié)果1.1實(shí)驗(yàn)期間,各組動(dòng)物體重均逐漸增加,各組體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。自染毒第4周起,各劑量1-BP染毒組可觀察到大鼠后肢抓力降低,呈劑量依賴(lài)性,EDV干預(yù)明顯改善1-BP導(dǎo)致的大鼠后肢抓力下降。1.2硫堇染色顯示,隨著1-BP染毒劑量增加,大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)尼式體著色逐漸變淺,表明神經(jīng)元損傷加重。EDV干預(yù)減輕了 1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)尼式體密度降低,改善了 1-BP導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷。1.3免疫組織化學(xué)染色顯示,1-BP染毒組可觀察到大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少,Iba-1染色陽(yáng)性細(xì)胞所占面積和GFAP染色陽(yáng)性細(xì)胞所占面積增加,均呈劑量依賴(lài)性。EDV干預(yù)能夠明顯逆轉(zhuǎn)1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元丟失、小膠質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。采用western blot檢測(cè)的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮NeuN、Iba-1、GFAP蛋白表達(dá)水平變化與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。1.4免疫雙熒光染色檢測(cè)結(jié)果顯示,NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞可觀察到凋亡相關(guān)蛋白Cleaved Caspase-3的共定位表達(dá),提示神經(jīng)元發(fā)生凋亡。EDV干預(yù)可明顯減少1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)Cleaved Caspase-3在NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞上的表達(dá)。western blot檢測(cè)大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)Cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)水平變化與形態(tài)學(xué)變化一致。1.5免疫雙熒光染色檢測(cè)大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)區(qū)NeuN和GFAP表達(dá),結(jié)果顯示1-BP導(dǎo)致大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)NeuN染色陽(yáng)性細(xì)胞減少,其周?chē)鶪FAP染色陽(yáng)性細(xì)胞增加,胞體增大、分支增多,高劑量1-BP染毒組可見(jiàn)膠質(zhì)瘢痕。EDV干預(yù)明顯改善了1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元丟失及星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。1.6 1-BP染毒可導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)Trx 1蛋白表達(dá)水平降低,呈劑量依賴(lài)性;p-ASK1(Thr 845)、p-p38及蛋白硝基化產(chǎn)物3-NT表達(dá)水平則呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性增加,表明1-BP染毒激活了 Trx1-ASK1-p38 MAPK凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路。EDV干預(yù)逆轉(zhuǎn)了 1-BP導(dǎo)致的Trx 1表達(dá)降低,降低了 p-ASK1(Thr 845)、p-p38及3-NT表達(dá)的增加,抑制了 1-BP導(dǎo)致的Trx1-ASK1-p38 MAPK凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路激活。1.7 1-BP染毒導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)NO水平和NOS活性升高,均呈劑量依賴(lài)性。EDV干預(yù)能夠明顯改善1-BP引起的大腦氮化應(yīng)激狀態(tài)。結(jié)論1.1 1-BP經(jīng)口染毒6周可導(dǎo)致大鼠后肢抓力下降,自由基清除劑EDV可明顯減輕1-BP的周?chē)窠?jīng)毒性,改善周?chē)窠?jīng)功能。1.2 1-BP染毒可導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活、神經(jīng)元凋亡,EDV可明顯糾正1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦神經(jīng)炎癥及神經(jīng)元丟失。1.3 1-BP染毒可導(dǎo)致大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)氧化/氮化應(yīng)激,激活Trx1-ASK1-p38 MAPK凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路,EDV干預(yù)可抑制1-BP對(duì)Trx1-ASK1-p38 MAPK通路的激活作用,減輕大腦氧化/氮化損傷。第二部分CYP2E1抑制劑烯丙基硫?qū)?-溴丙烷誘導(dǎo)大鼠周?chē)窠?jīng)毒性的影響研究目的代謝活化是多種化學(xué)物誘導(dǎo)神經(jīng)毒性的首發(fā)事件。1-BP體內(nèi)代謝過(guò)程復(fù)雜,CYP2E1是1-BP主要代謝酶。1-BP的C2經(jīng)肝臟CYP2E1氧化可生成活性代謝產(chǎn)物1-溴-2-丙醇(1-Bromo-2-propanol)和溴丙酮(3-Bromoacetone),為1-BP最主要且具有毒理學(xué)意義的代謝途徑。肝臟是人體主要代謝器官,而經(jīng)肝臟代謝的極性活性產(chǎn)物難以經(jīng)受長(zhǎng)距離的運(yùn)輸和透過(guò)血腦屏障(Blood brain barrier,BBB)。生理狀態(tài)下,大腦CYP2E1表達(dá)較低,研究顯示大腦CYP2E1可受外源化學(xué)物誘導(dǎo)。作為有機(jī)溶劑,1-BP本身極易進(jìn)入大腦,進(jìn)入腦內(nèi)的1-BP是否能夠誘導(dǎo)大腦CYP2E1表達(dá)?1-BP經(jīng)CYP2E1在腦內(nèi)原位的活化代謝是否是啟動(dòng)其神經(jīng)毒性的早期事件?本實(shí)驗(yàn)在1-BP染毒同時(shí)給予CYP2E1的特異性抑制劑抑制CYP2E1活性,觀察了對(duì)1-BP誘導(dǎo)周?chē)窠?jīng)損傷的影響,以及腦內(nèi)CYP2E1表達(dá)水平的改變,并分析了血液和大腦內(nèi)活性代謝產(chǎn)物的變化,以探討腦內(nèi)1-BP經(jīng)原位氧化代謝在其周?chē)窠?jīng)毒性中的作用。研究方法2.1動(dòng)物分組及處理:48只SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠,體重180-220 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為4組:空白對(duì)照組、1-BP染毒組、1-BP+烯丙基硫干預(yù)組及烯丙基硫?qū)φ战M,每組12只。經(jīng)口給予烯丙基硫(100 mg/kg.bw),4小時(shí)后,1-BP(800 mg/kg.bw)經(jīng)口染毒。每天一次,每周7天,直到1-BP染毒組大鼠出現(xiàn)癱瘓,共計(jì)9周。每周檢測(cè)各組大鼠后肢抓力,觀測(cè)大鼠步態(tài)情況、并進(jìn)行評(píng)分,實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诿芮杏^察各組大鼠后肢癱瘓情況。2.2各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)形態(tài)學(xué)觀察:大鼠體內(nèi)灌注固定,經(jīng)后固定和脫水,制備冠狀冰凍切片,采用硫堇染色、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)染色,觀察運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷及凋亡;采用免疫組織化學(xué)染色,觀察運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)細(xì)胞激活;采用免疫雙熒光染色檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞中CYP2E1的表達(dá)及M1/M2極化情況,并檢測(cè)神經(jīng)元氧化損傷及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。2.3大腦生化指標(biāo)檢測(cè):采用生化試劑盒檢測(cè)各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量及還原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量。2.4 Western blot檢測(cè)大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)相關(guān)蛋白表達(dá):采用western blot檢測(cè)各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì) NeuN、Iba-1、GFAP、Cleaved Caspase-3、CYP2E1、iNOS、精氨酸酶(Arginase-1,Arg-1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)及 p-NF-KB、Trx 1、ASK1 及 p-ASK1(Thr 845)、p38及 p-p38 的相對(duì)蛋白表達(dá)量,以評(píng)價(jià)神經(jīng)元丟失、膠質(zhì)細(xì)胞活化、小膠質(zhì)細(xì)胞極化及凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路激活情況。2.5 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化標(biāo)志物表達(dá):提取大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層組織RNA,逆轉(zhuǎn)為cDNA后,分別采用iNOS、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、IL-6、Arg-1、IL-10、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1(Transforming growth factor β1,Tgfb1)特異引物經(jīng)PCR擴(kuò)增,檢測(cè)各因子的mRNA表達(dá)量。2.6 1-BP染毒大腦中1-溴-2-丙醇含量測(cè)定:24只SPF級(jí)雄性成年Wistar大鼠,體重180-220 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,隨機(jī)分為空白對(duì)照組、1-BP染毒組、1-BP+烯丙基硫干預(yù)組及烯丙基硫?qū)φ战M,每組6只。1-BP染毒前4小時(shí),經(jīng)口給予烯丙基硫,劑量為100 mg/kg.bw。1-BP(800 mg/kg.bw)經(jīng)口染毒。每天一次。染毒5天后,經(jīng)頸靜脈取血后,處死動(dòng)物,取動(dòng)物大腦。采用動(dòng)態(tài)頂空-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(Dynamic headspace-gas chromatography-tandem mass spectrometry,GC-MS)定性定量檢測(cè)各組大鼠血液和腦組織中 1-BP經(jīng)CYP2E1代謝的活性產(chǎn)物1-溴-2-丙醇含量。結(jié)果2.1 1-BP經(jīng)口染毒導(dǎo)致大鼠體重增長(zhǎng)減慢,自染毒第5周起,與空白對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。抑制CYP2E1活性可明顯改善1-BP染毒導(dǎo)致的大鼠體重減輕。2.2硫堇、免疫組織化學(xué)染色顯示,1-BP染毒可導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷及數(shù)量減少。TUNEL染色及免疫雙熒光染色證實(shí),1-BP染毒動(dòng)物大腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡。烯丙基硫抑制CYP2E1活性能夠逆轉(zhuǎn)1-BP導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)神經(jīng)元損傷及凋亡。Western blot檢測(cè)大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮層的NeuN及Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。2.3 1-BP染毒導(dǎo)致大鼠后肢抓力下降,步態(tài)評(píng)分增加,染毒結(jié)束時(shí)(9周末)30%大鼠后肢癱瘓。烯丙基硫干預(yù)改善了 1-BP導(dǎo)致的大鼠后肢抓力下降及步態(tài)異常,1-BP導(dǎo)致的后肢癱瘓率下降20%。2.4免疫組織化學(xué)染色顯示,1-BP染毒導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞激活。烯丙基硫干預(yù)明顯減輕了 1-BP導(dǎo)致的膠質(zhì)細(xì)胞激活。Western blot檢測(cè)顯示,大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)Iba-1及GFAP蛋白表達(dá)水平變化趨勢(shì)與形態(tài)學(xué)結(jié)果一致。2.5免疫雙熒光染色顯示,1-BP染毒導(dǎo)致激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中CYP2E1表達(dá)增加,并被烯丙基硫抑制。Western blot證實(shí),烯丙基硫能夠抑制1-BP染毒導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)CYP2E1蛋白表達(dá)水平增加。2.6免疫雙熒光染色顯示,1-BP染毒導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞M1型極化增加,M2型極化減少,烯丙基硫干預(yù)能夠糾正1-BP導(dǎo)致的小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化失衡。Western blot及qRT-PCR結(jié)果證實(shí),烯丙基硫抑制1-BP引起的M1極化標(biāo)志iNOS蛋白表達(dá)的增加,并降低iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA水平的升高;改善M2極化標(biāo)志Arg-1蛋白表達(dá)的減少,以及Arg-1 mRNA表達(dá)的降低。2.7 Western blot檢測(cè)證實(shí),1-BP導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)NF-κB通路及Trx-ASK1-p38 MAPK凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路激活,此作用可被烯丙基硫抑制。2.8 1-BP染毒導(dǎo)致大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)MDA水平增加,GSH活性降低,并在NeuN熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞上觀察到大量4-HNE的共定位表達(dá)。烯丙基硫可抑制1-BP染毒導(dǎo)致的大鼠大腦運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)MDA水平增加、GSH活性降低,并降低神經(jīng)元中4-HNE氧化修飾蛋白水平。2.9 GC-MS檢測(cè)顯示,1-BP可升高染毒大鼠血液和大腦中1-BP氧化代謝活性產(chǎn)物1-溴-2-丙醇含量,烯丙基硫能夠明顯降低檢測(cè)組織中1-溴-2-丙醇含量。結(jié)論2.1 800 mg/kg.bw 1-BP經(jīng)口連續(xù)染毒,導(dǎo)致染毒大鼠后肢抓力進(jìn)行性下降,步態(tài)異常,染毒9周末出現(xiàn)后肢癱瘓。2.2 1-BP染毒可誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)小膠質(zhì)細(xì)胞中CYP2E1表達(dá),導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化失衡,并激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,引發(fā)腦內(nèi)氧化/氮化應(yīng)激及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡。2.3 1-BP染毒可升高1-BP染毒大鼠大腦和血液中活性氧化代謝產(chǎn)物1-溴-2-丙醇含量。2.4烯丙基硫能明顯抑制1-BP誘導(dǎo)的大鼠大腦和小膠質(zhì)細(xì)胞中CYP2E1表達(dá),降低1-溴-2-丙醇含量,糾正小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化失衡和神經(jīng)元損傷,有效減輕1-BP的周?chē)窠?jīng)毒性。第三部分小膠質(zhì)細(xì)胞釋放外泌體在1-溴丙烷誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷中的作用研究目的近年來(lái)外泌體介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)元通訊被認(rèn)為與神經(jīng)毒性在腦內(nèi)進(jìn)展性發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,腦內(nèi)的一些毒性蛋白如α-突觸核蛋白寡聚體、淀粉樣蛋白-β(Amyloid-β,Aβ)可借助外泌體的分泌實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞間的傳遞,導(dǎo)致慢性神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展�；谝陨涎芯�,本研究分別采用1-BP和烯丙基硫作用于體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,觀察BV-2細(xì)胞的M1/M2極化情況,及BV-2細(xì)胞中CYP2E1的表達(dá)情況。其后,采用1-BP的活性代謝產(chǎn)物1-溴-2-丙醇作用于體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,收集分泌的炎性外泌體,標(biāo)記后加入原代新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元培養(yǎng)體系中,觀察神經(jīng)元對(duì)標(biāo)記外泌體的攝取情況,探討1-BP神經(jīng)毒性的傳播機(jī)制。研究方法3.1 BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2極化及CYP2E1的表達(dá):將體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞,分別設(shè)置為空白對(duì)照組、1-BP、1-BP+烯丙基硫、烯丙基硫及LPS陽(yáng)性對(duì)照組,分別將1-BP、烯丙基硫和LPS加入培養(yǎng)體系,制備細(xì)胞爬片。作用24小時(shí)后,采用免疫雙熒光檢測(cè)各組BV-2細(xì)胞的M1/M2極化情況,及BV-2細(xì)胞中CYP2E1的表達(dá)情況。3.2 1-溴-2-丙醇激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞外泌體的收集:將體外培養(yǎng)的BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞設(shè)置為空白對(duì)照組和1-溴-2-丙醇處理組。將終濃度為1 mM的1-溴-2-丙醇加入培養(yǎng)體系。染毒24小時(shí),更換含有100 μMATP的無(wú)血清培養(yǎng)液,37℃孵育30分鐘。PBS清洗細(xì)胞2次,加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移到離心管中。梯度離心收集外泌體。3.3炎性外泌體鑒定:采用western blot檢測(cè)外泌體陽(yáng)性標(biāo)志蛋白ALIX、Flotillin-2表達(dá),并檢測(cè)外泌體中炎性因子IL-1β表達(dá)。采用日立HT-7700型透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài)。3.4外泌體標(biāo)記:采用細(xì)胞膜紅色親脂熒光探針DiI對(duì)分離的外泌體進(jìn)行標(biāo)記示蹤。將以上收集外泌體重懸于無(wú)菌PBS中后與適量DiI共同孵育10分鐘,采用無(wú)菌PBS清洗外泌體三次,去除游離DiI染料和雜質(zhì)。3.5神經(jīng)元對(duì)外泌體的攝取:分別將空白對(duì)照組和1-溴-2-丙醇處理組提取的DiI標(biāo)記外泌體(2 μg/mL)加入原代神經(jīng)元培養(yǎng)液中,采用無(wú)血清培養(yǎng)基共同孵育24小時(shí),PBS洗滌3次,采用MAP-2標(biāo)記神經(jīng)元觀察其形態(tài)變化,以及神經(jīng)元攝取外泌體情況。結(jié)果3.1免疫雙熒光染色顯示,1-BP染毒導(dǎo)致BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化,并誘導(dǎo)CYP2E1表達(dá)增加,M1/M2極化失衡。烯丙基硫干預(yù)可有效抑制1-BP誘導(dǎo)BV-2細(xì)胞CYP2E1的表達(dá),糾正其M1/M2極化失衡。3.2 1-溴-2-丙醇染毒導(dǎo)致BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞激活,免疫熒光染色結(jié)果表明,1-溴-2-丙醇增強(qiáng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化、減弱M2極化。3.3 Western blot檢測(cè)來(lái)自激活BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體,與空白對(duì)照組相比,1-溴-2-丙醇處理組細(xì)胞中外泌體陽(yáng)性標(biāo)志蛋白ALIX、Flotillin-2表達(dá)增加,IL-1β表達(dá)也明顯升高。3.4免疫雙熒光染色顯示,在原代神經(jīng)元培養(yǎng)體系中加入提取外泌體,神經(jīng)元胞體和軸突中可觀察到DiI標(biāo)記的外泌體。同時(shí)觀察到來(lái)自1-溴-2-丙醇染毒組的外泌體更易進(jìn)入原代培養(yǎng)的神經(jīng)元胞體中,并表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)元的損傷作用,神經(jīng)元軸突縮短或消失、胞體分解。結(jié)論3.1 1-BP染毒可導(dǎo)致體外培養(yǎng)BV-2小膠質(zhì)細(xì)胞活化,CYP2E1表達(dá)增加;烯丙基硫能夠明顯抑制1-BP誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞中CYP2E1表達(dá)和M1/M2極化失衡。3.2 1-溴-2-丙醇染毒導(dǎo)致BV-2細(xì)胞M1極化,M1極化BV-2細(xì)胞來(lái)源的炎性外泌體更易進(jìn)入原代培養(yǎng)的神經(jīng)元胞體中,并表現(xiàn)出對(duì)神經(jīng)元的損傷作用,神經(jīng)元軸突縮短或消失、胞體分解。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R114
【圖文】：

向并修理平整后，將大鼠腦組織切成４０邋ｎｍ厚的連續(xù)冠狀切片，儲(chǔ)存于含０．０１％逡逑疊氮鈉的ＰＢＳ中，放置４°Ｃ。根據(jù)Ｔｈｅ邋Ｒａｔ邋Ｂｒａｉｎ邋Ａｔｌａｓ中的大腦立體定位圖譜逡逑［６２］（如圖１－１）選擇包含初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層（Ｐｒｉｍａｒｙ邋ｍｏｔｏｒ邋ｃｏｒｔｅｘ，邋Ｍｌ邋）和次級(jí)運(yùn)邐．逡逑動(dòng)皮層（Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ邋ｍｏｔｏｒ邋ｃｏｒｔｅｘ，Ｍ２）區(qū)域分別染色觀察神經(jīng)兀、小膠質(zhì)細(xì)胞逡逑和星型膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化。逡逑９—Ｌ—」ｒ￣邋二，遽１【與＇．：，沾］逡逑ｔｏａａｕｐｊ邋ｉｐ．７２邐｜邋ｊ邋｜邐｜．．．邋．邋｜逡逑圖１－１．大鼠大腦立體定位圖譜（引自Ｔｈｅ邋Ｒａｔ邋Ｂｒａｉｎ邋Ａｔｌａｓ）逡逑１．３．３．２腦切片硫堇染色逡逑從各組大鼠大腦冰凍切片中，挑選相同位置附近切片，ＰＢＳ漂洗一遍后，逡逑固定于正電荷防脫的載玻片上，３７°Ｃ千燥３０分鐘。雙蒸水漂洗載玻片后，將載逡逑玻片放入裝有硫堇染色溶液的染色缸中染色２０分鐘，顯微鏡下觀察染色情況。逡逑３６逡逑

Ｗｅｅｋｓ逡逑圖１－２．各劑量１－ＢＰ染毒及ＥＤＶ干預(yù)對(duì)大鼠體重的影響逡逑１－ＢＰ染毒期間，各組大鼠一般狀態(tài)良好。如圖１－２所示，各組大鼠體重在前逡逑４周呈穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，其后各組體重變化基本保持穩(wěn)定，各劑量１－ＢＰ染毒組大鼠逡逑與空白對(duì)照組相比，體重變化均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑４３逡逑

（與空白對(duì)照組相比，＞＜０．０５，＊＞：０．０１；與８００ｍｇ／ｋｇ．ｂｗｌ－ＢＰ組相比，＇＜０．０１）逡逑為了觀察ＥＤＶ對(duì)１－ＢＰ所致周?chē)窠?jīng)毒性的保護(hù)作用，我們檢測(cè)了各組大鼠逡逑的后肢抓力。圖１－３為各組大鼠后肢抓力變化情況。實(shí)驗(yàn)前三周，各組大鼠后肢逡逑抓力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，自染毒第四周起，２００邋ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ，４００邋ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ，８００逡逑ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ邋１－ＢＰ染毒導(dǎo)致大鼠后肢抓力不同程度減小，與空白對(duì)照組相比，差異逡逑有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ｐ＜０．０１）。８００邋ｍｇ／ｋｇ．ｂｗ邋１－ＢＰ染毒組大鼠后肢抓力下降最為嚴(yán)逡逑重，且染毒結(jié)束時(shí)損傷的后肢抓力并未恢復(fù)。預(yù)防性給予ＥＤＶ明顯改善了邋１－ＢＰ逡逑染毒導(dǎo)致的大鼠后肢抓力下降（；？＜０．０１）。逡逑４４逡逑

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本文編號(hào)：2791083