【摘要】：金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌是兩類嚴(yán)重威脅食品安全的致病菌,由兩種致病菌造成的中毒事件較多。目前傳統(tǒng)微生物檢測(cè)鑒定既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力,基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法是靈敏度高,但依賴于精密、昂貴的設(shè)備和專業(yè)操作人員,限制了其應(yīng)用。本研究中建立了重組酶聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增(RPA)和試紙條(LF)結(jié)合的方法,用于快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌,該方法操作簡(jiǎn)便,靈敏度高,特異性強(qiáng)。RPA是一種新型的擴(kuò)增方法,可以在較低的溫度下(37℃～42℃)下,，220min內(nèi)完成檢測(cè),是被稱為最接近“等溫?cái)U(kuò)增”的方法。本實(shí)驗(yàn)以金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌特異基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)引物,將正反引物分別標(biāo)記地高辛(digoxin)和生物素(biotin),經(jīng)RPA擴(kuò)增后生成雙標(biāo)記的DNA產(chǎn)物,其與膠體金或彩色乳膠微球標(biāo)記的抗digoxin抗體發(fā)生相互作用后攜帶有顯色物質(zhì),最終可以在LF上出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的結(jié)果。本研究對(duì)RPA-LF檢測(cè)金黃色葡萄球菌的條件進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)果顯示RPA擴(kuò)增金黃色葡萄球菌的最佳條件為40℃擴(kuò)增10min,靈敏度分析結(jié)果顯示RPA-LF可檢測(cè)500 fg DNA和1.2 X 101 CFU/mL金黃色葡萄球菌純菌液;特異性結(jié)果顯示RPA-LF特異性良好,對(duì)表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、腸炎沙門(mén)氏菌等均沒(méi)有交叉反應(yīng);利用雞肉、牛奶、雞蛋等實(shí)際樣品檢驗(yàn)方法的檢測(cè)效果,結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)增菌和檢測(cè)后,在4.5小時(shí)內(nèi)可檢出食品樣品中1.2×100CFU/mL(g)的金黃色葡萄球菌。本研究同樣優(yōu)化了 RPA-LF檢測(cè)單增李斯特菌的方法,結(jié)果顯示RPA擴(kuò)增單增李斯特菌的最佳條件為39℃擴(kuò)增10 min;靈敏度分析結(jié)果顯示RPA-LF可檢測(cè)300 fg基因組DNA和1.5 X 101CFU/mL單增李斯特菌純菌液;特異性結(jié)果顯示RPA-LF未與格氏李斯特菌、西爾李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、霍亂沙門(mén)氏菌和志賀氏菌發(fā)生交叉反應(yīng);用食物樣品評(píng)估RPA-LF檢測(cè)效果,結(jié)果顯示增菌6 h后,檢測(cè)限為1.5×100CFU/mL(g)。重組聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)合試紙條檢測(cè)具有快速、高特異性和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。實(shí)際樣品的檢測(cè)過(guò)程僅需4.5～6h,不需要復(fù)雜的熱循環(huán)裝置,只需一臺(tái)簡(jiǎn)單的數(shù)字化水浴鍋即可完成檢測(cè),同時(shí)對(duì)操作人員的技術(shù)要求不高,非常適用于食品企業(yè)和偏遠(yuǎn)地區(qū)致病菌的快速檢測(cè)。
【學(xué)位授予單位】：天津科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R155.5
【圖文】：

它常見(jiàn)食源性致病菌株的基因組ＤＮＡ，產(chǎn)物未檢測(cè)出非特異性擴(kuò)增的條帶，由此說(shuō)逡逑明引物特異性強(qiáng)，而且條帶清晰明亮，故選擇／＾ｃ－Ｆｌ／ｍ＾－Ｒｌ作為后續(xù)試驗(yàn)所用引物，逡逑見(jiàn)圖３－１和３－２。逡逑圖３－１邋？ｍｏＦ１／？？ｃ－Ｒ１引物特異性驗(yàn)證逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：實(shí)驗(yàn)室所篩金黃色葡萄球菌，７：陰性逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：邋ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋／ｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ逡逑ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，邋７：ｎａｇｅｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑圖３－２邋ｍ／ｃ－Ｆｌ／／ｗｃ－Ｒｌ引物特異性驗(yàn)證逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：實(shí)驗(yàn)室所篩金黃色葡萄球菌，４：大腸桿l#５：沙門(mén)氏菌，逡逑６：產(chǎn)氣桿菌，７：?jiǎn)卧隼钏固鼐�，８：表皮葡萄球菌，９：陰性逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ邋ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋，逡逑２２逡�?

它常見(jiàn)食源性致病菌株的基因組ＤＮＡ，產(chǎn)物未檢測(cè)出非特異性擴(kuò)增的條帶，由此說(shuō)逡逑明引物特異性強(qiáng)，而且條帶清晰明亮，故選擇／＾ｃ－Ｆｌ／ｍ＾－Ｒｌ作為后續(xù)試驗(yàn)所用引物，逡逑見(jiàn)圖３－１和３－２。逡逑圖３－１邋？ｍｏＦ１／？？ｃ－Ｒ１引物特異性驗(yàn)證逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：實(shí)驗(yàn)室所篩金黃色葡萄球菌，７：陰性逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：邋ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋／ｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ逡逑ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，邋７：ｎａｇｅｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑圖３－２邋ｍ／ｃ－Ｆｌ／／ｗｃ－Ｒｌ引物特異性驗(yàn)證逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：實(shí)驗(yàn)室所篩金黃色葡萄球菌，４：大腸桿l#５：沙門(mén)氏菌，逡逑６：產(chǎn)氣桿菌，７：?jiǎn)卧隼钏固鼐�，８：表皮葡萄球菌，９：陰性逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ邋ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋，逡逑２２逡�?

顯示出特異擴(kuò)增的目標(biāo)條帶，大小與理論目標(biāo)值一致，空白對(duì)照和其它常逡逑見(jiàn)食源性致病菌株的基因組ＤＮＡ，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，由此說(shuō)明引物特異性逡逑強(qiáng)，而且條帶清晰明量，故選擇作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用引物，見(jiàn)圖３－３。逡逑圖３－３腳Ａ－Ｆ１／Ｗ＿Ｍ－Ｒ１引物特異性驗(yàn)證逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１，７：ＡＴＣＣ邋１９１１５，２：邋ＡＴＣＣ邋１９１１１，３：ＡＴＣＣ邋１５３１３，邋５：ＡＴＣＣ邋７６４４，邋６：ＣＩＣＣ邋２１６３３，邋４：逡逑陰性，８：金黃色葡萄球菌，９：沙門(mén)氏菌，１０：大腸桿菌，１１：產(chǎn)氣桿菌，１２：表皮葡萄球菌．１３：空腸彎曲桿逡逑菌逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｌｙＡ－ＹＭｈｌｙＡ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１，７：ＡＴＣＣ邋１９１１５，２：邋ＡＴＣＣ邋１９１１１，邋３：邋ＡＴＣＣ邋１５３１３，邋５：ＡＴＣＣ邋７６４４，邋６：ＣＩＣＣ邋２１６３３，邋４：逡逑ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ，邋８：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ，邋９：邋Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，邋１０：邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ，邋１１：逡逑Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ邋ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，邋１２：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，邋１３：邋Ｃｍｎｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｊｅｊｕｎｉ逡逑３．２優(yōu)化重組聚合酶恒溫?cái)U(kuò)增結(jié)果逡逑３．２．１重組酶聚合酶擴(kuò)增金黃色葡萄球菌優(yōu)化結(jié)果逡逑在不同溫度和時(shí)間條件下應(yīng)用ＲＰＡ擴(kuò)增＃黃色葡萄球菌，結(jié)果表明ＲＰＡ在逡逑３０°Ｃ－４５°Ｃ均可以擴(kuò)增金黃色葡萄球菌

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉繼超;姜鐵民;劉豐;岳華;張咚咚;陳歷俊;;TaqMan探針熒光定量PCR檢測(cè)金黃色葡萄球菌腸毒素D[J];食品工業(yè)科技;2014年21期

2 陳愛(ài)亮;;食源性病原微生物快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)[J];食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào);2014年01期

3 張p蕘

本文編號(hào)：2786275